Expression génique du système endocannabinoïde chez les patients souffrant de migraine épisodique et chronique

La migraine est une maladie neurovasculaire dont la physiopathologie est loin d'être totalement élucidée. Cela est principalement dû aux mécanismes complexes qui sous-tendent la crise de migraine ainsi qu'à sa récurrence. Le système endocannabinoïde (ES) est un système de signalisation complexe impliqué dans différents processus biologiques (par ex. activité neuronale, sensation de douleur et fonctions immunitaires) et il joue un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie du corps. Les composants ES comprennent les lipides endogènes, les plus étudiés étant le N-arachidonoyléthanolamide (AEA) et le 2-arachidonoylglycérol (2-AG), leurs enzymes métaboliques et au moins deux récepteurs cannabinoïdes (CB1 et CB2). La biosynthèse de l'AEA se produit principalement par la N-acylphosphatidyléthanolamide-phospholipase D (NAPE-PLD), tandis que le 2-AG est produit par l'action de la diacylglycérol lipase (DAGL). L'AEA est métabolisé par l'acide gras amide hydrolase (FAAH) et le 2-AG principalement par la monoacylglycérol lipase (MAGL).

Les altérations de l'expression génique des composants ES peuvent impliquer divers types de cellules, de multiples voies cataboliques et la génération de métabolites actifs via des mécanismes épigénétiques, dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les gènes CB, par exemple, peuvent interagir avec différents facteurs de transcription, dont beaucoup sont liés à la méthylation de l'ADN et aux modifications post-traductionnelles des histones. Un SE dysfonctionnel a été associé à de nombreux troubles, dont la migraine. Le SE, en effet, module de multiples activités et neuromodulateurs/neurotransmetteurs qui jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de la migraine. ES est également impliqué dans la modulation descendante de la transmission nociceptive trigéminovasculaire à partir des afférences du tronc cérébral. Des études antérieures du Laboratoire de neurophysiologie des systèmes autonomes intégratifs, Headache Science Center, IRCCS Mondino Foundation, Pavie (Italie), utilisant le modèle animal spécifique à la migraine basé sur l'administration de nitroglycérine chez le rat, ont démontré l'existence d'interactions entre le SE et la médiation de la douleur . En particulier, les chercheurs ont montré un rôle clé pour l'AEA et pour l'activité de l'AEA régulée par la FAAH dans le traitement des signaux nociceptifs du trijumeau. L'AEA inhibe la vasodilatation durale neurogène, ainsi que la dilatation des vaisseaux duraux induite par les peptides liés au gène de la calcitonine et induite par l'oxyde nitrique, une activité qui est inversée par l'antagonisme CB1. L'interaction entre le SE et la douleur migraineuse est également suggérée par des observations cliniques. L'activité FAAH était plus élevée dans les plaquettes des femmes souffrant de migraine épisodique (EM) pour suggérer une dégradation plus marquée de l'AEA. Les sujets souffrant de migraine chronique (CM) et de surconsommation de médicaments (MO) ont montré un métabolisme endocannabinoïde altéré non seulement dans les plaquettes, mais aussi dans le LCR. Bien que les résultats cliniques ci-dessus soient dispersés et reproduits, leur réexamen à la lumière de données plus récentes provenant de l'augmentation des preuves précliniques incite à la nécessité d'étudier plus en profondeur le rôle de la SE dans la physiopathologie de la migraine.

Plusieurs études suggèrent que les changements dans les composants ES détectés dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont des indicateurs fiables d'un dysfonctionnement central de l'ES dans différentes maladies neurologiques. Par exemple, chez les patients atteints de la maladie de Parkinson ou de sclérose en plaques, l'augmentation des taux d'AEA dans le LCR était associée à une réduction de l'activité et de la teneur en protéines du FAAH dans les PBMC, ce qui indique une augmentation du tonus de l'AEA. Les taux d'AEA étaient élevés dans le LCR et dans le sang des sujets schizophrènes, avec une baisse significative des taux sanguins d'AEA et des transcrits d'ARNm de CB2 et de FAAH dans les PBMC après la rémission clinique.

Le but de cette étude était l'identification de schémas fonctionnels spécifiques de l'activité ES chez les sujets souffrant de migraine. À cette fin, les chercheurs ont effectué une évaluation approfondie de plusieurs composants périphériques de l'ES (expression génique, expression protéique et méthylation de l'ADN) dans les PBMC d'échantillons représentatifs de sujets atteints d'EM sans aura, CM-MO et chez des témoins sains (CT).

Vingt-cinq sujets avec EM, 26 avec CM-MO et 24 CT ont été inscrits au centre de la céphalée de la Fondation IRCCS Mondino de Pavie (Italie). L'étude a été approuvée par le comité d'éthique local et tous les sujets inscrits ont signé un consentement éclairé écrit.

Des échantillons de sang (20 ml) ont été prélevés dans des tubes contenant de l'acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) des participants. Les échantillons de sang ont été dilués dans un rapport 1: 1 avec une solution saline de tampon phosphate 1X (PBS 1X) (Sigma). Les échantillons de sang dilués ont été lentement chargés sur une solution de séparation Ficoll (15 ml) (Sigma) et centrifugés à 800 g sans frein pendant 30 min à température ambiante. Les PBMC accumulés sous forme de monocouche blanche moyenne ont été lavés deux fois dans du PBS 1X stérile et centrifugés à 300 g pendant 15 min. Pour chaque échantillon, un lot de PBMC a été utilisé pour l'extraction d'ARN ou d'ADN et un autre pour l'analyse par cytomètre en flux.

Dans les PBMC isolées des sujets des 3 groupes d'étude, les investigateurs ont dosé :

• expression des protéines CB1 et CB2 ;
• expression des gènes suivants : récepteurs CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL et DAGL
• Méthylation de l'ADN des composants ES. Pour déterminer le niveau relatif d'expression des protéines CB1 et CB2 dans les PBMC, les chercheurs ont utilisé la cytométrie en flux avec un cytomètre en flux FACS Canto (Becton-Dickenson). Après isolement, les cellules (100 000 par réaction) ont été colorées à l'aide d'anticorps dirigés contre les récepteurs CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (R&D system, 1:50) et CB2 (Cayman Chemical, 1:30); un total de 10 000 événements ont été comptés dans les fenêtres fermées pour l'intersection de la coloration CD45 avec CB1 et CB2.

L'ARN total des PBMC a été isolé en utilisant la procédure standard (Zymo Research) et la qualité de l'ARN a été évaluée à l'aide d'un spectrophotomètre nanodrop (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific) ; L'ADNc a été généré à l'aide du kit de synthèse d'ADNc iScript (Biorad) en suivant les instructions du fournisseur. L'expression génique des récepteurs CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL et DAGL a été analysée à l'aide du supermix Fast Eva Green (BIO-RAD). L'ubiquitine (UBC), dont l'expression est restée constante dans tous les groupes expérimentaux, a été utilisée comme gène domestique. L'amplification a été réalisée avec un Light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) en suivant les instructions du fournisseur. Tous les échantillons ont été testés en triple et les niveaux d'expression génique ont été calculés selon la formule 2-∆Ct = 2- (gène Ct - gène domestique Ct) en utilisant les valeurs Ct.

Étant donné que les PBMC contiennent la totalité des enzymes épigénétiques présentes dans la plupart des tissus, y compris les neurones et les cellules nucléées périphériques, les chercheurs ont évalué le rôle de la méthylation de l'ADN dans la régulation de la transcription du gène ES chez tous les sujets inscrits.

L'ADN a été extrait du sang total à l'aide du kit QIAmp DNA Blood Mini (Qiagen) et sa concentration a été déterminée par quantification NanoDrop (NanoDrop Techologies, Thermofisher). La préparation des matrices et l'analyse des données ont été réalisées par Genomix4Life srl (Baronissi, Italie). L'ADN de haute qualité (500 ng) a été converti au bisulfite à l'aide du kit de méthylation d'ADN EZ (Zymo Research, Irvine, CA, USA). L'ADN converti au bisulfite (200 ng) a été utilisé pour l'analyse de la méthylation du génome entier, à l'aide du HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA), qui contient 485 577 sondes couvrant 21 231 (99 %) gènes RefSeq. En bref, l'ADN converti au bisulfite a été amplifié en génome entier pendant 20 h, suivi d'une fragmentation au point final. L'ADN fragmenté a été précipité, dénaturé et hybridé aux BeadChips pendant 20 h à 48 °C. Les BeadChips ont été lavés et les amorces hybridées ont été étendues et marquées avant de scanner les BeadChips à l'aide du système Illumina iScan. Logiciel GenomeStudio (version 2011.1 ; Illumina Inc.) a été utilisé pour l'extraction des signaux de méthylation de l'ADN à partir de puces numérisées. Le niveau de méthylation pour chaque cytosine a été exprimé sous la forme d'une valeur bêta calculée comme le rapport d'intensité de fluorescence des versions méthylées et non méthylées des sondes : les valeurs bêta variaient entre 0 (non méthylé) et 1 (méthylé). L'annotation relative aux CGI utilise la catégorisation suivante : « shore », chacune des séquences de 2 kb encadrant un CGI ; 'shelf', chacune des séquences de 2 ko à côté d'un rivage; "mer ouverte", ADN non inclus dans aucune des séquences précédentes ou dans les CGI 4. TSS200 et TSS1500 indiquent la région entre la position -200 bp et -1500 bp du TSS, respectivement. La différence significative de méthylation entre deux loci donnés est indiquée par une valeur delta-bêta et déterminée avec le module de méthylation GenomeStudio en utilisant l'algorithme personnalisé d'Illumina pour calculer les DiffScores (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval < 0,001) = hypo-méthylation ; DiffScore⩾30.0 (≈ p val<0,001) = hyper-méthylation).