Экспрессия генов эндоканнабиноидной системы у пациентов с эпизодической и хронической мигренью

Мигрень — нервно-сосудистое заболевание, патофизиология которого далеко не до конца выяснена. В основном это связано со сложными механизмами, лежащими в основе приступа мигрени, а также ее рецидивов. Эндоканнабиноидная система (ЭС) представляет собой сложную сигнальную систему, участвующую в различных биологических процессах (например, активность нейронов, болевые ощущения и иммунные функции) и играет решающую роль в поддержании гомеостаза организма. Компоненты ЭС включают эндогенные липиды, наиболее изученными из которых являются N-арахидоноилэтаноламид (АЭА) и 2-арахидоноилглицерол (2-АГ), их метаболические ферменты и по крайней мере два каннабиноидных рецептора (CB1 и CB2). Биосинтез AEA в основном происходит с помощью N-ацилфосфатидилэтаноламид-фосфолипазы D (NAPE-PLD), тогда как 2-AG продуцируется под действием диацилглицероллипазы (DAGL). AEA метаболизируется гидролазой амидов жирных кислот (FAAH), а 2-AG в основном моноацилглицероллипазой (MAGL).

Изменения в экспрессии генов компонентов ЭС могут включать различные типы клеток, множественные катаболические пути и образование активных метаболитов посредством эпигенетических механизмов как при физиологических, так и при патологических состояниях. Гены CB, например, могут взаимодействовать с различными транскрипционными факторами, многие из которых связаны с метилированием ДНК и посттрансляционными модификациями гистонов. Дисфункция ЭС связана с многочисленными расстройствами, включая мигрень. ES, действительно, модулирует множественную активность и нейромодуляторы/нейротрансмиттеры, которые играют решающую роль в патогенезе мигрени. ЭС также участвует в нисходящей модуляции тригеминоваскулярной ноцицептивной передачи от афферентных стволовых клеток. Предыдущие исследования в Лаборатории нейрофизиологии интегративных вегетативных систем Научного центра головной боли Фонда IRCCS Mondino, Павия (Италия) с использованием специфической модели мигрени на животных, основанной на введении нитроглицерина крысам, продемонстрировали существование взаимодействий между ЭС и опосредованием боли. . В частности, исследователи показали ключевую роль AEA и активности AEA, регулируемой FAAH, в обработке ноцицептивных сигналов тройничного нерва. AEA ингибирует нейрогенную вазодилатацию твердой мозговой оболочки, а также дилатацию сосудов твердой мозговой оболочки, индуцированную пептидом, связанным с геном кальцитонина, и индуцированную оксидом азота, действие, которое устраняется антагонизмом CB1. Взаимодействие между ЭС и болью при мигрени также подтверждается клиническими наблюдениями. Активность FAAH была выше в тромбоцитах женщин с эпизодической мигренью (ЭМ), что свидетельствует о более выраженной деградации AEA. У субъектов с хронической мигренью (ХМ) и чрезмерным употреблением лекарств (ЗН) был обнаружен измененный метаболизм эндоканнабиноидов не только в тромбоцитах, но и в спинномозговой жидкости. Несмотря на то, что приведенные выше клинические данные разрозненны и воспроизведены, их повторное рассмотрение в свете более поздних данных из растущего количества доклинических данных указывает на необходимость более глубокого изучения роли ЭС в патофизиологии мигрени.

Ряд исследований позволяет предположить, что изменения компонентов ЭС, выявляемые в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), являются надежными индикаторами центральной дисфункции ЭС при различных неврологических заболеваниях. Например, у пациентов с болезнью Паркинсона или рассеянным склерозом повышенные уровни AEA в спинномозговой жидкости были связаны со снижением активности и содержания белка FAAH в PBMC, что свидетельствует о повышенном тонусе AEA. Уровни AEA были повышены в спинномозговой жидкости и в крови больных шизофренией со значительным снижением уровней AEA в крови и транскриптов мРНК CB2 и FAAH в РВМС после клинической ремиссии.

Целью данного исследования было выявление специфических функциональных паттернов активности ЭС у лиц, страдающих мигренью. С этой целью исследователи провели тщательную оценку множества периферических компонентов ЭС (экспрессии генов, экспрессии белков и метилирования ДНК) в РВМС репрезентативных образцов субъектов с ЭМ без ауры, ВМ-МО и у здоровых контролей (КТ).

Двадцать пять пациентов с EM, 26 с CM-MO и 24 CT были зачислены в центр головной боли IRCCS Mondino Foundation в Павии (Италия). Исследование было одобрено местным комитетом по этике, и все участники подписали письменное информированное согласие.

Образцы крови (20 мл) были собраны у участников в пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Образцы крови разводили в соотношении 1:1 фосфатно-солевым буфером 1X (PBS 1X) (Sigma). Разведенные образцы крови медленно наносили на разделяющий раствор фиколла (15 мл) (Sigma) и центрифугировали при 800 g без торможения в течение 30 мин при комнатной температуре. PBMC, накопленные в виде среднего белого монослоя, дважды промывали стерильным PBS 1X и центрифугировали при 300 g в течение 15 мин. Для каждого образца использовали одну партию РВМС для выделения РНК или ДНК, а другую — для анализа на проточном цитометре.

В РВМС, выделенных от субъектов в 3 группах исследования, исследователи проанализировали:

• экспрессия белков CB1 и CB2;
• экспрессия следующих генов: рецепторы CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL и DAGL
• Метилирование ДНК компонентов ЭС. Чтобы определить относительный уровень экспрессии белков CB1 и CB2 в PBMC, исследователи использовали проточную цитометрию с помощью проточного цитометра FACS Canto (Becton-Dickenson). После выделения клетки (100 000 на реакцию) окрашивали антителами к рецепторам CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (R&D system, 1:50) и CB2 (Cayman Chemical, 1:30); всего было подсчитано 10000 событий в окнах, закрытых для пересечения окрашивания CD45 с CB1 и CB2.

Тотальную РНК из РВМС выделяли с использованием стандартной процедуры (Zymo Research) и качество РНК оценивали с помощью спектрофотометра с нанокаплями (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); кДНК генерировали с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Biorad) в соответствии с инструкциями поставщика. Экспрессию генов рецепторов CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL и DAGL анализировали с использованием супермикса Fast Eva Green (BIO-RAD). В качестве гена домашнего хозяйства использовали убиквитин (UBC), экспрессия которого оставалась постоянной во всех экспериментальных группах. Амплификацию проводили с помощью легкой системы обнаружения RT-PCR Cycler 480 Instrument (Roche) в соответствии с инструкциями поставщика. Все образцы анализировали в трех повторностях, и уровни экспрессии генов рассчитывали в соответствии с формулой 2-∆Ct = 2- (ген Ct - ген домашнего хозяйства Ct) с использованием значений Ct.

Поскольку РВМС содержат полный набор эпигенетических ферментов, обнаруженных в большинстве тканей, включая нейроны и периферические ядросодержащие клетки, исследователи оценили роль метилирования ДНК в регуляции транскрипции генов ЭС у всех включенных в исследование субъектов.

ДНК экстрагировали из цельной крови с использованием набора QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) и определяли ее концентрацию с помощью количественного определения NanoDrop (NanoDrop Techologies, Thermofisher). Подготовку массивов и анализ данных выполняли Genomix4Life srl (Baronissi, Италия). Высококачественную ДНК (500 нг) подвергали бисульфитной конверсии с использованием набора для метилирования ДНК EZ (Zymo Research, Ирвин, Калифорния, США). Преобразованную бисульфитом ДНК (200 нг) использовали для анализа метилирования всего генома с использованием чипа HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), который содержит 485 577 зондов, охватывающих 21 231 (99%) ген RefSeq. Вкратце, ДНК, преобразованную бисульфитом, подвергали амплификации всего генома в течение 20 часов с последующей фрагментацией конечной точки. Фрагментированную ДНК осаждали, денатурировали и гибридизовали с BeadChips в течение 20 часов при 48°C. BeadChips промывали, а гибридизированные праймеры наращивали и метили перед сканированием BeadChips с использованием системы Illumina iScan. Программное обеспечение GenomeStudio (версия 2011.1; Illumina Inc.) использовали для выделения сигналов метилирования ДНК из сканированных матриц. Уровень метилирования для каждого цитозина выражали в виде значения бета, рассчитанного как отношение интенсивности флуоресценции метилированных и неметилированных версий зондов: значения бета находились в диапазоне от 0 (неметилированные) до 1 (метилированные). В аннотации, относящейся к CGI, используется следующая классификация: «берег» — каждая из последовательностей размером 2 т.п.н., примыкающих к CGI; «полка» — каждая из последовательностей размером 2 т.п.н. рядом с берегом; «открытое море», ДНК, не включенная ни в одну из предыдущих последовательностей или в CGI 4. TSS200 и TSS1500 обозначают область между положениями -200 п.н. и -1500 п.н. от TSS соответственно. Значительная разница в метилировании между двумя заданными локусами указывается значением дельта-бета и определяется с помощью модуля метилирования GenomeStudio с использованием специального алгоритма Illumina для расчета DiffScores (DiffScore ⩽-30,0). (≈ pval <0,001) = гипометилирование; DiffScore⩾30,0 (≈ p val<0,001) = гиперметилирование).