Genuttryck av endocannabinoidsystem hos episodiska och kroniska migränpatienter

Migrän är en neurovaskulär sjukdom vars patofysiologi är långt ifrån helt klarlagd. Detta beror främst på de komplexa mekanismer som ligger till grund för migränanfall samt dess återkommande. Endocannabinoidsystemet (ES) är ett komplext signalsystem involverat i olika biologiska processer (t. neuronal aktivitet, smärtkänsla och immunfunktioner) och den spelar en avgörande roll i upprätthållandet av kroppens homeostas. ES-komponenterna inkluderar de endogena lipiderna, de mest studerade är N-arakidonoyletanolamid (AEA) och 2-arakidonoylglycerol (2-AG), deras metaboliska enzymer och minst två cannabinoidreceptorer (CB1 och CB2). Biosyntesen av AEA sker huvudsakligen av N-acylfosfatidyletanolamid-fosfolipas D (NAPE-PLD), medan 2-AG produceras genom inverkan av diacylglycerollipas (DAGL). AEA metaboliseras av fettsyraamidhydrolas (FAAH) och 2-AG huvudsakligen av monoacylglycerollipas (MAGL).

Förändringar i genuttryck av ES-komponenter kan involvera olika celltyper, flera katabola vägar och generering av aktiva metaboliter via epigenetiska mekanismer, under både fysiologiska och patologiska tillstånd. CB-gener, till exempel, kan interagera med olika transkriptionsfaktorer, av vilka många är relaterade till DNA-metylering och posttranslationella modifieringar av histon. En dysfunktionell ES har associerats med många sjukdomar inklusive migrän. ES modulerar faktiskt flera aktiviteter och neuromodulatorer/neurotransmittorer som spelar en avgörande roll i migränpatogenes. ES är också inblandat i den fallande moduleringen av den trigeminovaskulära nociceptiva överföringen från hjärnstammens afferenter. Tidigare studier från Laboratory of Neurophysiology of Integrative Autonomic Systems, Headache Science Centre, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Italien), med användning av den migränspecifika djurmodellen baserad på nitroglycerinadministration i råtta, visade förekomsten av interaktioner mellan ES och smärtmediering . I synnerhet visade utredarna en nyckelroll för AEA och för FAAH-reglerad AEA-aktivitet i behandlingen av trigeminus nociceptiva signaler. AEA hämmar neurogen dural vasodilatation, såväl som kalcitoningenrelaterad peptidinducerad och kväveoxidinducerad utvidgning av duralkärl, en aktivitet som reverseras av CB1-antagonism. Interaktionen mellan ES och migränsmärta föreslås också av kliniska observationer. FAAH-aktiviteten var högre i blodplättar hos kvinnor med episodisk migrän (EM) vilket tyder på en mer markant nedbrytning av AEA. Försökspersoner med kronisk migrän (CM) och medicinöveranvändning (MO) visade en förändrad endocannabinoidmetabolism inte bara i blodplättar utan även i CSF. Även om ovanstående kliniska fynd är spridda och replikerade, gör deras omprövning i ljuset av nyare data från den ökande prekliniska evidensen behovet av att undersöka mer djupgående rollen av ES i migränpatofysiologi.

Flera studier tyder på att förändringar i ES-komponenter som upptäcks i perifera mononukleära blodceller (PBMC) är pålitliga indikatorer på en central dysfunktion av ES i olika neurologiska sjukdomar. Till exempel, hos patienter med Parkinsons sjukdom eller multipel skleros, var ökade CSF-nivåer av AEA associerade med en minskning av aktiviteten och proteininnehållet av FAAH i PBMC, vilket tyder på en ökad AEA-tonus. AEA-nivåer var förhöjda i CSF och i blodet hos schizofrena försökspersoner, med en signifikant minskning av AEA-blodnivåer och i mRNA-transkript av CB2 och FAAH i PBMCs efter klinisk remission.

Syftet med denna studie var att identifiera specifika funktionella mönster av ES-aktivitet hos personer med migrän. För detta ändamål utförde utredarna en grundlig utvärdering av flera perifera komponenter i ES (genuttryck, proteinuttryck och DNA-metylering) i PBMCs av representativa prover av försökspersoner med EM utan aura, CM-MO och i friska kontroller (CT).

Tjugofem försökspersoner med EM, 26 med CM-MO och 24 CT var inskrivna i huvudvärkscentret hos IRCCS Mondino Foundation of Pavia (Italien). Studien godkändes av den lokala etiska kommittén och alla inskrivna försökspersoner skrev under ett skriftligt informerat samtycke.

Blodprover (20 ml) samlades in i etylendiamintetraättiksyra (EDTA) innehållande rör från deltagarna. Blodprover späddes i förhållandet 1:1 med fosfatbuffert saltlösning 1X (PBS 1X) (Sigma). Utspädda blodprov laddades långsamt på Ficoll-separeringslösning (15 ml) (Sigma) och centrifugerades vid 800 g utan broms i 30 minuter vid rumstemperatur. PBMCs ackumulerade som det mellersta vita monoskiktet, tvättades två gånger i steril PBS 1X och centrifugerades vid 300 g under 15 minuter. För varje prov användes en sats av PBMC för RNA- eller DNA-extraktion och en annan för flödescytometeranalys.

I PBMCs isolerade från försökspersonerna i de tre studiegrupperna analyserade forskarna:

• CB1- och CB2-proteinuttryck;
• uttryck av följande gener: CB-receptorer, FAAH, NAPE-PLD, MAGL och DAGL
• DNA-metylering av ES-komponenter. För att bestämma den relativa nivån av CB1- och CB2-proteinuttryck i PBMC:er använde utredarna flödescytometri med en FACS Canto flödescytometer (Becton-Dickenson). Efter isolering färgades celler (100 000 per reaktion) med antikroppar mot CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (Fo-system, 1:50) och CB2-receptorer (Cayman Chemical, 1:30); totalt 10 000 händelser räknades i fönster som var gated för korsningen av CD45-färgning med CB1 och CB2.

Totalt RNA från PBMC isolerades med standardförfarande (Zymo Research) och RNA-kvalitet bedömdes med användning av en nanodrop-spektrofotometer (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); cDNA genererades med hjälp av iScript cDNA Synthesis kit (Biorad) enligt leverantörens instruktioner. Genuttryck av CB-receptorer, FAAH, NAPE-PLD, MAGL och DAGL analyserades med hjälp av Fast Eva Green supermix (BIO-RAD). Ubiquitin (UBC), vars uttryck förblev konstant i alla experimentella grupper, användes som hushållsgen. Amplifieringen utfördes med ett lätt Cycler 480 Instrument rt-PCR-detektionssystem (Roche) enligt leverantörens instruktioner. Alla prover analyserades i tre exemplar och genuttrycksnivåer beräknades enligt formeln 2-∆Ct = 2- (Ct-gen - Ct-hushållningsgen) genom att använda Ct-värden.

Eftersom PBMC innehåller det fulla komplementet av epigenetiska enzymer som finns i de flesta vävnader, inklusive neuroner och perifera kärnförsedda celler, utvärderade forskarna rollen av DNA-metylering i regleringen av ES-gentranskription i alla inskrivna försökspersoner.

DNA extraherades från helblod med QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) och dess koncentration bestämdes genom NanoDrop-kvantifiering (NanoDrop Techologies, Thermofisher). Arrayförberedelser och dataanalys utfördes av Genomix4Life srl (Baronissi, Italien). Högkvalitativt DNA (500 ng) bisulfitkonverterades med hjälp av EZ DNA-metyleringskit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfitkonverterat DNA (200ng) användes för analys av helgenomets metylering, med hjälp av HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA), som innehåller 485 577 prober som täcker 21 231 (99 %) RefSeq-gener. I korthet, bisulfitkonverterat DNA amplifierades helgenom i 20 timmar följt av ändpunktsfragmentering. Fragmenterat DNA fälldes ut, denaturerades och hybridiserades till BeadChips under 20 timmar vid 48 °C. BeadChips tvättades och de hybridiserade primrarna förlängdes och märktes innan BeadChips skannades med hjälp av Illumina iScan-systemet. GenomeStudio programvara (version 2011.1; Illumina Inc.) användes för extraktion av DNA-metyleringssignaler från skannade arrayer. Metyleringsnivån för varje cytosin uttrycktes som ett betavärde beräknat som fluorescensintensitetsförhållandet för de metylerade till ometylerade versionerna av proberna: betavärden varierade mellan 0 (ometylerad) och 1 (metylerad). Anteckningen som hänför sig till CGI:er använder följande kategorisering: "shore", var och en av de 2-kb sekvenser som flankerar en CGI; 'hylla', var och en av sekvenserna på 2 kb bredvid en strand; "öppet hav", DNA som inte ingår i någon av de tidigare sekvenserna eller i CGIs 4. TSS200 och TSS1500 indikerar regionen mellan position -200 bp respektive -1500 bp från TSS. Den signifikanta metyleringsskillnaden mellan två givna loci indikeras av ett delta-beta-värde och bestäms med GenomeStudio Methylation Module med hjälp av Illumina anpassad algoritm för beräkning av DiffScores (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0,001)=hypometylering; DiffScore⩾30,0 (≈ p val<0,001)=hypermetylering).