Genová exprese endokanabinoidního systému u pacientů s epizodickou a chronickou migrénou

Migréna je neurovaskulární onemocnění, jehož patofyziologie není zdaleka zcela objasněna. Je to způsobeno především složitými mechanismy, které jsou základem záchvatu migrény a také jeho opakování. Endokanabinoidní systém (ES) je komplexní signální systém zapojený do různých biologických procesů (např. neuronální aktivita, vnímání bolesti a imunitní funkce) a hraje klíčovou roli při udržování tělesné homeostázy. Mezi složky ES patří endogenní lipidy, z nichž nejvíce studovanými jsou N-arachidonoylethanolamid (AEA) a 2-arachidonoylglycerol (2-AG), jejich metabolické enzymy a alespoň dva kanabinoidní receptory (CB1 a CB2). K biosyntéze AEA dochází hlavně prostřednictvím N-acylfosfatidylethanolamid-fosfolipázy D (NAPE-PLD), zatímco 2-AG je produkován působením diacylglycerollipázy (DAGL). AEA je metabolizován amidhydrolázou mastných kyselin (FAAH) a 2-AG hlavně monoacylglycerollipázou (MAGL).

Změny v genové expresi komponent ES mohou zahrnovat různé typy buněk, mnohočetné katabolické dráhy a tvorbu aktivních metabolitů prostřednictvím epigenetických mechanismů za fyziologických i patologických podmínek. Geny CB mohou například interagovat s různými transkripčními faktory, z nichž mnohé souvisí s methylací DNA a posttranslačními modifikacemi histonů. Dysfunkční ES bylo spojeno s řadou poruch včetně migrény. ES skutečně moduluje četné aktivity a neuromodulátory/neurotransmitery, které hrají klíčovou roli v patogenezi migrény. ES se také podílí na sestupné modulaci trigeminovaskulárního nociceptivního přenosu z aferentů mozkového kmene. Předchozí studie z Laboratory of Neurophysiology of Integrative Autonomic Systems, Headache Science Centre, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Itálie), používající zvířecí model specifický pro migrénu založený na podávání nitroglycerinu u potkanů, prokázaly existenci interakcí mezi ES a zprostředkováním bolesti . Konkrétně výzkumníci prokázali klíčovou roli pro AEA a pro FAAH-regulovanou AEA aktivitu při zpracování trigeminálních nociceptivních signálů. AEA inhibuje neurogenní durální vazodilataci, stejně jako dilataci durálních cév indukovanou peptidem souvisejícím s kalcitoninovým genem a oxidem dusnatým, aktivitu, která je zvrácena antagonismem CB1. Interakce mezi ES a migrenózní bolestí je také naznačena klinickými pozorováními. Aktivita FAAH byla vyšší u krevních destiček žen s epizodickou migrénou (EM), což naznačuje výraznější degradaci AEA. Subjekty s chronickou migrénou (CM) a nadužíváním léků (MO) vykazovaly změněný metabolismus endokanabinoidů nejen v krevních destičkách, ale také v CSF. Ačkoli jsou výše uvedené klinické nálezy roztroušeny a replikovány, jejich opětovné zvážení ve světle novějších údajů z přibývajících předklinických důkazů vyvolává potřebu hlouběji prozkoumat roli ES v patofyziologii migrény.

Několik studií naznačuje, že změny složek ES detekované v mononukleárních buňkách periferní krve (PBMC) jsou spolehlivými indikátory centrální dysfunkce ES u různých neurologických onemocnění. Například u pacientů s Parkinsonovou chorobou nebo roztroušenou sklerózou byly zvýšené hladiny AEA v CSF spojeny se snížením aktivity a obsahu proteinů FAAH v PBMC, což svědčí o zvýšeném tonusu AEA. Hladiny AEA byly zvýšeny v mozkomíšním moku a v krvi schizofrenních subjektů s významným poklesem hladin AEA v krvi a mRNA transkriptů CB2 a FAAH v PBMC po klinické remisi.

Cílem této studie byla identifikace specifických funkčních vzorců aktivity ES u subjektů s migrénou. Za tímto účelem výzkumníci provedli důkladné vyhodnocení více periferních složek ES (genová exprese, exprese proteinů a metylace DNA) v PBMC reprezentativních vzorků subjektů s EM bez aury, CM-MO a u zdravých kontrol (CT).

Dvacet pět subjektů s EM, 26 s CM-MO a 24 CT bylo zařazeno do centra pro bolesti hlavy IRCCS Mondino Foundation of Pavia (Itálie). Studie byla schválena místní etickou komisí a všechny zapsané subjekty podepsaly písemný informovaný souhlas.

Vzorky krve (20 ml) byly od účastníků odebírány do zkumavek obsahujících kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA). Vzorky krve byly zředěny v poměru 1:1 fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem IX (PBS 1X) (Sigma). Zředěné vzorky krve byly pomalu naneseny na separační roztok Ficoll (15 ml) (Sigma) a centrifugovány při 800 g bez brzdění po dobu 30 minut při teplotě místnosti. PBMC akumulované jako střední bílá monovrstva byly dvakrát promyty sterilním PBS IX a centrifugovány při 300 g po dobu 15 minut. Pro každý vzorek byla dávka PBMC použita pro extrakci RNA nebo DNA a další pro analýzu průtokovým cytometrem.

V PBMC izolovaných od subjektů ve 3 studijních skupinách výzkumníci testovali:

• exprese proteinů CB1 a CB2;
• exprese následujících genů: CB receptory, FAAH, NAPE-PLD, MAGL a DAGL
• Methylace DNA složek ES. Pro stanovení relativní úrovně exprese proteinů CB1 a CB2 v PBMC výzkumníci použili průtokovou cytometrii s průtokovým cytometrem FACS Canto (Becton-Dickenson). Po izolaci byly buňky (100 000 na reakci) obarveny pomocí protilátek proti CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (systém R&D, 1:50) a receptorům CB2 (Cayman Chemical, 1:30); celkem 10 000 událostí bylo napočítáno v oknech uzavřených pro průnik barvení CD45 s CB1 a CB2.

Celková RNA z PBMC byla izolována standardním postupem (Zymo Research) a kvalita RNA byla hodnocena pomocí nanokapkového spektrofotometru (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); cDNA byla vytvořena pomocí iScript cDNA Synthesis kitu (Biorad) podle instrukcí dodavatele. Genová exprese CB receptorů, FAAH, NAPE-PLD, MAGL a DAGL byla analyzována pomocí Fast Eva Green supermix (BIO-RAD). Ubiquitin (UBC), jehož exprese zůstala konstantní ve všech experimentálních skupinách, byl použit jako provozní gen. Amplifikace byla provedena pomocí lehkého Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) podle pokynů dodavatele. Všechny vzorky byly testovány v triplikátech a hladiny genové exprese byly vypočteny podle vzorce 2-∆Ct = 2- (Ct gen - Ct housekeeping gen) pomocí Ct hodnot.

Protože PBMC obsahují kompletní komplement epigenetických enzymů nacházejících se ve většině tkání, včetně neuronů a periferních jaderných buněk, vyšetřovatelé hodnotili roli metylace DNA v regulaci transkripce genu ES u všech zařazených subjektů.

DNA byla extrahována z plné krve pomocí QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) a její koncentrace byla stanovena kvantifikací NanoDrop (NanoDrop Techologies, Thermofisher). Příprava polí a analýza dat byly provedeny společností Genomix4Life srl (Baronissi, Itálie). Vysoce kvalitní DNA (500 ng) byla bisulfitově převedena pomocí metylačního kitu EZ DNA (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfitově konvertovaná DNA (200 ng) byla použita pro analýzu methylace celého genomu pomocí HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA), který obsahuje 485 577 sond pokrývajících 21 231 (99 %) genů RefSeq. Stručně řečeno, bisulfitově přeměněná DNA byla celogenomově amplifikována po dobu 20 hodin, po které následovala koncová fragmentace. Fragmentovaná DNA byla precipitována, denaturována a hybridizována na BeadChips po dobu 20 hodin při 48 °C. BeadChips byly promyty a hybridizované primery byly prodlouženy a označeny před skenováním BeadChips pomocí systému Illumina iScan. Software GenomeStudio (verze 2011.1; Illumina Inc.) byl použit pro extrakci signálů methylace DNA ze skenovaných polí. Úroveň methylace pro každý cytosin byla vyjádřena jako hodnota beta vypočtená jako poměr intenzity fluorescence methylovaných a nemethylovaných verzí sond: hodnoty beta se pohybovaly mezi 0 (nemethylované) a 1 (methylované). Anotace týkající se CGI používá následující kategorizaci: 'shore', každá z 2kb sekvencí lemujících CGI; 'shelf', každá z 2-kb sekvencí vedle břehu; 'otevřené moře', DNA nezahrnutá v žádné z předchozích sekvencí ani v CGI 4. TSS200 a TSS1500 označují oblast mezi polohou -200 bp a -1500 bp z TSS, v daném pořadí. Významný metylační rozdíl mezi dvěma danými lokusy je indikován hodnotou delta-beta a stanoven pomocí methylačního modulu GenomeStudio s použitím vlastního algoritmu Illumina pro výpočet DiffScores (DiffScore⩽-30,0 (≈ pval <0,001)=hypo-methylace; Rozdílové skóre⩾30,0 (≈ p val<0,001)=hypermethylace).