Espressione genica del sistema endocannabinoide nei pazienti con emicrania episodica e cronica

L'emicrania è una malattia neurovascolare la cui fisiopatologia è lungi dall'essere completamente chiarita. Ciò è dovuto principalmente ai complessi meccanismi che sono alla base dell'attacco di emicrania e alla sua ricorrenza. Il sistema endocannabinoide (ES) è un complesso sistema di segnalazione coinvolto in diversi processi biologici (ad es. attività neuronale, sensazione di dolore e funzioni immunitarie) e svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi corporea. I componenti ES includono i lipidi endogeni, i più studiati sono N-arachidonoiletanolamide (AEA) e 2-arachidonoilglicerolo (2-AG), i loro enzimi metabolici e almeno due recettori dei cannabinoidi (CB1 e CB2). La biosintesi dell'AEA avviene principalmente mediante N-acilfosfatidiletanolamide-fosfolipasi D (NAPE-PLD), mentre il 2-AG è prodotto attraverso l'azione della diacilglicerolo lipasi (DAGL). L'AEA è metabolizzata dall'ammide idrolasi degli acidi grassi (FAAH) e 2-AG principalmente dalla monoacilglicerolo lipasi (MAGL).

Le alterazioni nell'espressione genica dei componenti ES possono coinvolgere vari tipi di cellule, molteplici vie cataboliche e la generazione di metaboliti attivi attraverso meccanismi epigenetici, sia in condizioni fisiologiche che patologiche. I geni CB, ad esempio, possono interagire con diversi fattori trascrizionali, molti dei quali sono correlati alla metilazione del DNA e alle modifiche post-traduzionali dell'istone. Un ES disfunzionale è stato associato a numerosi disturbi tra cui l'emicrania. L'ES, infatti, modula molteplici attività e neuromodulatori/neurotrasmettitori che giocano un ruolo cruciale nella patogenesi dell'emicrania. ES è anche implicato nella modulazione discendente della trasmissione nocicettiva trigeminovascolare dalle afferenze del tronco encefalico. Precedenti studi del Laboratorio di Neurofisiologia dei Sistemi Autonomici Integrativi, Headache Science Center, IRCCS Fondazione Mondino, Pavia (Italia), utilizzando il modello animale specifico dell'emicrania basato sulla somministrazione di nitroglicerina nel ratto, hanno dimostrato l'esistenza di interazioni tra l'ES e la mediazione del dolore . In particolare, i ricercatori hanno mostrato un ruolo chiave per l'AEA e per l'attività dell'AEA regolata dalla FAAH nell'elaborazione dei segnali nocicettivi del trigemino. L'AEA inibisce la vasodilatazione durale neurogena, così come la dilatazione dei vasi durali indotta dal peptide correlato al gene della calcitonina e l'ossido nitrico, un'attività che è invertita dall'antagonismo CB1. L'interazione tra ES e dolore emicranico è suggerita anche da osservazioni cliniche. L'attività della FAAH era più alta nelle piastrine delle donne con emicrania episodica (EM) a suggerire una degradazione più marcata dell'AEA. I soggetti con emicrania cronica (CM) e uso eccessivo di farmaci (MO) hanno mostrato un metabolismo endocannabinoide alterato non solo nelle piastrine, ma anche nel liquido cerebrospinale. Sebbene i risultati clinici di cui sopra siano sparsi e replicati, la loro riconsiderazione alla luce dei dati più recenti derivanti dalle crescenti evidenze precliniche richiede la necessità di indagare in modo più approfondito il ruolo dell'ES nella fisiopatologia dell'emicrania.

Diversi studi suggeriscono che i cambiamenti nei componenti dell'ES rilevati nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) sono indicatori affidabili di una disfunzione centrale dell'ES in diverse malattie neurologiche. Ad esempio, nei pazienti con malattia di Parkinson o sclerosi multipla, l'aumento dei livelli di AEA nel liquido cerebrospinale è stato associato a una riduzione dell'attività e del contenuto proteico di FAAH nelle PBMC, il che è indicativo di un aumento del tono AEA. I livelli di AEA erano elevati nel liquido cerebrospinale e nel sangue dei soggetti schizofrenici, con un calo significativo dei livelli ematici di AEA e delle trascrizioni di mRNA di CB2 e FAAH nelle PBMC dopo la remissione clinica.

Lo scopo di questo studio era l'identificazione di specifici pattern funzionali dell'attività ES in soggetti con emicrania. A tal fine, i ricercatori hanno eseguito una valutazione approfondita di molteplici componenti periferici dell'ES (espressione genica, espressione proteica e metilazione del DNA) in PBMC di campioni rappresentativi di soggetti con EM senza aura, CM-MO e in controlli sani (CT).

Venticinque soggetti con EM, 26 con CM-MO e 24 CT sono stati arruolati nel centro cefalee della Fondazione IRCCS Mondino di Pavia (Italia). Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico locale e tutti i soggetti arruolati hanno firmato un consenso informato scritto.

I campioni di sangue (20 ml) sono stati raccolti all'interno di provette contenenti acido etilendiammina tetra-acetico (EDTA) dai partecipanti. I campioni di sangue sono stati diluiti in rapporto 1:1 con tampone fosfato salino 1X (PBS 1X) (Sigma). I campioni di sangue diluiti sono stati caricati lentamente sulla soluzione di separazione Ficoll (15 ml) (Sigma) e centrifugati a 800 g senza freno per 30 minuti a temperatura ambiente. I PBMC accumulati come monostrato bianco medio, sono stati lavati due volte in PBS 1X sterile e centrifugati a 300 g per 15 minuti. Per ogni campione, è stato utilizzato un lotto di PBMC per l'estrazione dell'RNA o del DNA e un altro per l'analisi del citometro a flusso.

Nelle PBMC isolate dai soggetti nei 3 gruppi di studio i ricercatori hanno analizzato:

• espressione delle proteine ​​CB1 e CB2;
• espressione dei seguenti geni: recettori CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL e DAGL
• Metilazione del DNA dei componenti ES. Per determinare il livello relativo dell'espressione proteica CB1 e CB2 nei PBMC, i ricercatori hanno utilizzato la citometria a flusso con un citometro a flusso FACS Canto (Becton-Dickenson). Dopo l'isolamento, le cellule (100000 per reazione) sono state colorate utilizzando anticorpi contro i recettori CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (R&D system, 1:50) e CB2 (Cayman Chemical, 1:30); un totale di 10000 eventi sono stati contati in finestre chiuse per l'intersezione della colorazione CD45 con CB1 e CB2.

L'RNA totale dalle PBMC è stato isolato utilizzando una procedura standard (Zymo Research) e la qualità dell'RNA è stata valutata utilizzando uno spettrofotometro nanodrop (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); Il cDNA è stato generato utilizzando il kit iScript cDNA Synthesis (Biorad) seguendo le istruzioni del fornitore. L'espressione genica dei recettori CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL e DAGL è stata analizzata utilizzando il supermix Fast Eva Green (BIO-RAD). L'ubiquitina (UBC), la cui espressione è rimasta costante in tutti i gruppi sperimentali, è stata utilizzata come gene housekeeping. L'amplificazione è stata eseguita con un Light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) seguendo le istruzioni del fornitore. Tutti i campioni sono stati analizzati in triplicato e i livelli di espressione genica sono stati calcolati secondo la formula 2-∆Ct = 2- (gene Ct - gene housekeeping Ct) utilizzando i valori Ct.

Poiché le PBMC contengono il complemento completo degli enzimi epigenetici presenti nella maggior parte dei tessuti, compresi i neuroni e le cellule nucleate periferiche, i ricercatori hanno valutato il ruolo della metilazione del DNA nella regolazione della trascrizione del gene ES in tutti i soggetti arruolati.

Il DNA è stato estratto dal sangue intero utilizzando QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) e la sua concentrazione è stata determinata mediante quantificazione NanoDrop (NanoDrop Techologies, Thermofisher). La preparazione degli array e l'analisi dei dati sono state eseguite da Genomix4Life srl (Baronissi, Italia). Il DNA di alta qualità (500 ng) è stato convertito con bisolfito utilizzando il kit di metilazione del DNA EZ (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Il DNA convertito con bisolfito (200 ng) è stato utilizzato per l'analisi della metilazione dell'intero genoma, utilizzando HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA), che contiene 485 577 sonde che coprono 21 231 (99%) geni RefSeq. In breve, il DNA convertito con bisolfito è stato amplificato dell'intero genoma per 20 ore seguito dalla frammentazione del punto finale. Il DNA frammentato è stato precipitato, denaturato e ibridato nei BeadChips per 20 ore a 48 °C. I BeadChip sono stati lavati e i primer ibridati sono stati estesi ed etichettati prima di scansionare i BeadChip utilizzando il sistema Illumina iScan. Software GenomeStudio (versione 2011.1; Illumina Inc.) è stato utilizzato per l'estrazione dei segnali di metilazione del DNA dagli array scansionati. Il livello di metilazione per ciascuna citosina è stato espresso come valore beta calcolato come rapporto di intensità di fluorescenza delle versioni metilate e non metilate delle sonde: i valori beta variavano tra 0 (non metilato) e 1 (metilato). L'annotazione relativa ai CGI utilizza la seguente categorizzazione: 'shore', ciascuna delle sequenze di 2 kb che fiancheggiano un CGI; 'shelf', ciascuna delle sequenze da 2 kb accanto a una riva; 'mare aperto', DNA non incluso in nessuna delle sequenze precedenti o nei CGI 4. TSS200 e TSS1500 indicano rispettivamente la regione tra la posizione -200 bp e -1500 bp dal TSS. La significativa differenza di metilazione tra due loci dati è indicata da un valore delta-beta e determinata con GenomeStudio Methylation Module utilizzando l'algoritmo personalizzato Illumina per il calcolo dei DiffScore (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0,001)=ipo-metilazione; DiffScore⩾30.0 (≈ p val<0.001)=iper-metilazione).