Expresión génica del sistema endocannabinoide en pacientes con migraña episódica y crónica

La migraña es una enfermedad neurovascular cuya fisiopatología está lejos de estar completamente esclarecida. Esto se debe principalmente a los complejos mecanismos que subyacen al ataque de migraña, así como a su recurrencia. El sistema endocannabinoide (ES) es un sistema de señalización complejo involucrado en diferentes procesos biológicos (p. actividad neuronal, sensación de dolor y funciones inmunitarias) y juega un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis corporal. Los componentes de los SE incluyen los lípidos endógenos, siendo los más estudiados la N-araquidonoiletanolamida (AEA) y el 2-araquidonoilglicerol (2-AG), sus enzimas metabólicas y al menos dos receptores cannabinoides (CB1 y CB2). La biosíntesis de AEA se produce principalmente por la N-acilfosfatidiletanolamida-fosfolipasa D (NAPE-PLD), mientras que la 2-AG se produce por la acción de la diacilglicerol lipasa (DAGL). La AEA se metaboliza por la amida hidrolasa de ácidos grasos (FAAH) y el 2-AG, principalmente por la monoacilglicerol lipasa (MAGL).

Las alteraciones en la expresión génica de los componentes de SE pueden involucrar varios tipos de células, múltiples vías catabólicas y la generación de metabolitos activos a través de mecanismos epigenéticos, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Los genes CB, por ejemplo, pueden interactuar con diferentes factores transcripcionales, muchos de los cuales están relacionados con la metilación del ADN y las modificaciones postraduccionales de las histonas. Un SE disfuncional se ha asociado con numerosos trastornos, incluida la migraña. El ES, de hecho, modula múltiples actividades y neuromoduladores/neurotransmisores que juegan un papel crucial en la patogénesis de la migraña. ES también está implicado en la modulación descendente de la transmisión nociceptiva trigeminovascular de los aferentes del tronco encefálico. Estudios previos del Laboratorio de Neurofisiología de Sistemas Autonómicos Integrativos, Centro de Ciencias del Dolor de Cabeza, Fundación IRCCS Mondino, Pavía (Italia), utilizando el modelo animal específico de migraña basado en la administración de nitroglicerina en rata, demostraron la existencia de interacciones entre el EE y la mediación del dolor. . En particular, los investigadores demostraron un papel clave para la AEA y para la actividad de la AEA regulada por FAAH en el procesamiento de las señales nociceptivas del trigémino. La AEA inhibe la vasodilatación dural neurogénica, así como la dilatación de los vasos durales inducida por el óxido nítrico y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina, una actividad que es revertida por el antagonismo de CB1. Las observaciones clínicas también sugieren la interacción entre el EE y el dolor de migraña. La actividad de FAAH fue mayor en las plaquetas de mujeres con migraña episódica (EM) para sugerir una degradación más marcada de AEA. Los sujetos con migraña crónica (MC) y abuso de medicación (MO) mostraron un metabolismo endocannabinoide alterado no solo en las plaquetas, sino también en el LCR. Aunque los hallazgos clínicos anteriores están dispersos y replicados, su reconsideración a la luz de los datos más recientes de la creciente evidencia preclínica plantea la necesidad de investigar con mayor profundidad el papel de los EE en la fisiopatología de la migraña.

Varios estudios sugieren que los cambios en los componentes del SE detectados en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son indicadores confiables de una disfunción central del SE en diferentes enfermedades neurológicas. Por ejemplo, en pacientes con enfermedad de Parkinson o esclerosis múltiple, los niveles aumentados de AEA en el LCR se asociaron con una reducción en la actividad y el contenido de proteína de FAAH en PBMC, lo que es indicativo de un tono aumentado de AEA. Los niveles de AEA se elevaron en el líquido cefalorraquídeo y en la sangre de sujetos esquizofrénicos, con una caída significativa en los niveles sanguíneos de AEA y en las transcripciones de ARNm de CB2 y FAAH en PBMC después de la remisión clínica.

El objetivo de este estudio fue la identificación de patrones funcionales específicos de actividad de ES en sujetos con migraña. Con este fin, los investigadores realizaron una evaluación exhaustiva de múltiples componentes periféricos del SE (expresión génica, expresión de proteínas y metilación del ADN) en PBMC de muestras representativas de sujetos con EM sin aura, CM-MO y controles sanos (CT).

Veinticinco sujetos con EM, 26 con CM-MO y 24 con CT se inscribieron en el centro de dolor de cabeza de la Fundación IRCCS Mondino de Pavia (Italia). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética local y todos los sujetos incluidos firmaron un consentimiento informado por escrito.

Se recogieron muestras de sangre (20 ml) en tubos que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de los participantes. Las muestras de sangre se diluyeron en una proporción de 1:1 con tampón de fosfato salino 1X (PBS 1X) (Sigma). Las muestras de sangre diluida se cargaron lentamente en solución de separación de Ficoll (15 ml) (Sigma) y se centrifugaron a 800 g sin freno durante 30 min a temperatura ambiente. Las PBMC acumuladas como monocapa blanca intermedia se lavaron dos veces en PBS 1X estéril y se centrifugaron a 300 g durante 15 min. Para cada muestra, se utilizó un lote de PBMC para la extracción de ARN o ADN y otro para el análisis con citómetro de flujo.

En las PBMC aisladas de los sujetos de los 3 grupos de estudio, los investigadores analizaron:

• expresión de proteínas CB1 y CB2;
• expresión de los siguientes genes: receptores CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL y DAGL
• Metilación del ADN de componentes ES. Para determinar el nivel relativo de expresión de proteínas CB1 y CB2 en PBMC, los investigadores utilizaron citometría de flujo con un citómetro de flujo FACS Canto (Becton-Dickenson). Después del aislamiento, las células (100000 por reacción) se tiñeron usando anticuerpos contra los receptores CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (R&D system, 1:50) y CB2 (Cayman Chemical, 1:30); se contaron un total de 10000 eventos en ventanas cerradas para la intersección de la tinción de CD45 con CB1 y CB2.

El ARN total de las PBMC se aisló mediante un procedimiento estándar (Zymo Research) y la calidad del ARN se evaluó mediante un espectrofotómetro de nanogotas (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); El ADNc se generó utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Biorad) siguiendo las instrucciones del proveedor. La expresión génica de los receptores CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL y DAGL se analizó utilizando la supermezcla Fast Eva Green (BIO-RAD). La ubiquitina (UBC), cuya expresión se mantuvo constante en todos los grupos experimentales, se utilizó como gen de limpieza. La amplificación se realizó con un Light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) siguiendo las instrucciones del proveedor. Todas las muestras se analizaron por triplicado y los niveles de expresión génica se calcularon de acuerdo con la fórmula 2-∆Ct = 2- (gen Ct - gen doméstico Ct) usando los valores de Ct.

Dado que las PBMC contienen el complemento completo de enzimas epigenéticas que se encuentran en la mayoría de los tejidos, incluidas las neuronas y las células nucleadas periféricas, los investigadores evaluaron el papel de la metilación del ADN en la regulación de la transcripción del gen ES en todos los sujetos inscritos.

El ADN se extrajo de sangre completa utilizando el kit QIAmp DNA Blood Mini (Qiagen) y su concentración se determinó mediante cuantificación NanoDrop (NanoDrop Techologies, Thermofisher). La preparación de matrices y el análisis de datos fueron realizados por Genomix4Life srl (Baronissi, Italia). El ADN de alta calidad (500 ng) se convirtió con bisulfito utilizando el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.). Se usó ADN convertido con bisulfito (200 ng) para el análisis de la metilación del genoma completo, usando HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.), que contiene 485 577 sondas que cubren 21 231 (99 %) genes RefSeq. En resumen, el ADN convertido con bisulfito se amplificó en todo el genoma durante 20 h, seguido de la fragmentación del punto final. El ADN fragmentado se precipitó, desnaturalizó e hibridó con los BeadChips durante 20 ha 48 °C. Los BeadChips se lavaron y los cebadores hibridados se extendieron y etiquetaron antes de escanear los BeadChips con el sistema Illumina iScan. Software GenomeStudio (versión 2011.1; Illumina Inc.) se utilizó para la extracción de señales de metilación de ADN de matrices escaneadas. El nivel de metilación para cada citosina se expresó como un valor beta calculado como la relación de intensidad de fluorescencia de las versiones metiladas y no metiladas de las sondas: los valores beta oscilaron entre 0 (no metilado) y 1 (metilado). La anotación relativa a los CGI utiliza la siguiente categorización: 'orilla', cada una de las secuencias de 2 kb que flanquean un CGI; 'estante', cada una de las secuencias de 2 kb junto a una orilla; 'mar abierto', ADN no incluido en ninguna de las secuencias anteriores ni en CGIs 4. TSS200 y TSS1500 indican la región entre la posición -200 pb y -1500 pb del TSS, respectivamente. La diferencia significativa de metilación entre dos loci dados se indica mediante un valor delta-beta y se determina con el módulo de metilación de GenomeStudio utilizando el algoritmo personalizado de Illumina para calcular DiffScores (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0,001) = hipometilación; DifScore⩾30.0 (≈ p val<0.001)=hipermetilación).