우발성 및 만성 편두통 환자에서 Endocannabinoid 시스템의 유전자 발현

편두통은 그 병태생리학이 완전히 규명되지 않은 신경혈관 질환이다. 이것은 주로 편두통 발작과 재발의 근간이 되는 복잡한 메커니즘 때문입니다. 체내칸나비노이드 시스템(ES)은 다양한 생물학적 과정(예: 신경 활동, 통증 감각 및 면역 기능) 신체 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다. ES 구성 요소에는 내인성 지질이 포함되며 가장 많이 연구된 것은 N-아라키도노일에탄올아미드(AEA) 및 2-아라키도노일글리세롤(2-AG), 이들의 대사 효소 및 적어도 두 개의 칸나비노이드 수용체(CB1 및 CB2)입니다. AEA의 생합성은 주로 N-아실포스파티딜에탄올아미드-포스포리파제 D(NAPE-PLD)에 의해 발생하는 반면, 2-AG는 디아실글리세롤 리파제(DAGL)의 작용을 통해 생성됩니다. AEA는 지방산 아미드 가수분해효소(FAAH)에 의해 대사되고 2-AG는 주로 모노아실글리세롤 리파아제(MAGL)에 의해 대사됩니다.

ES 구성요소의 유전자 발현의 변경은 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 다양한 세포 유형, 다중 이화 ​​경로 및 후생유전학적 메커니즘을 통한 활성 대사산물의 생성을 포함할 수 있습니다. 예를 들어, CB 유전자는 다른 전사 인자와 상호 작용할 수 있으며, 그 중 다수는 DNA 메틸화 및 히스톤 번역 후 변형과 관련이 있습니다. 기능 장애 ES는 편두통을 포함한 수많은 장애와 관련이 있습니다. 실제로 ES는 편두통 병인에서 중요한 역할을 하는 여러 활동 및 신경 조절제/신경 전달 물질을 조절합니다. ES는 또한 뇌간 구심성으로부터의 삼차신경혈관 침해수용성 전달의 하강 변조에 연루되어 있다. 쥐의 니트로글리세린 투여에 기초한 편두통 특이적 동물 모델을 사용하여 파비아(이탈리아) IRCCS 몬디노 재단(IRCCS Mondino Foundation)의 통합 자율 시스템 신경생리학 연구소(Laboratory of Neurophysiology of Integrative Autonomic Systems, Headache Science Centre)의 이전 연구는 ES와 통증 중재 사이의 상호작용의 존재를 입증했습니다. . 특히 연구자들은 삼차신경 통각 신호 처리에서 AEA와 FAAH 규제 AEA 활동의 핵심 역할을 보여주었습니다. AEA는 CB1 길항 작용에 의해 역전되는 활성인 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 유도 및 산화질소 유도 경막 혈관 확장뿐만 아니라 신경성 경막 혈관 확장을 억제합니다. ES와 편두통 통증 사이의 상호 작용은 또한 임상 관찰에 의해 제안됩니다. FAAH 활동은 간헐적 편두통(EM)이 있는 여성의 혈소판에서 더 높았으며 이는 AEA의 더 현저한 분해를 시사합니다. 만성 편두통(CM)과 약물 남용(MO)이 있는 피험자는 혈소판뿐만 아니라 CSF에서도 변화된 체내칸나비노이드 대사를 보였습니다. 위의 임상 결과가 흩어져 있고 복제되었지만 증가하는 전임상 증거의 최신 데이터에 비추어 재고하면 편두통 병리 생리학에서 ES의 역할을 더 깊이 조사할 필요가 있습니다.

몇몇 연구는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 검출된 ES 구성 요소의 변화가 다른 신경계 질환에서 ES의 중추 기능 장애의 신뢰할 수 있는 지표임을 시사합니다. 예를 들어, 파킨슨병 또는 다발성 경화증 환자에서 AEA의 증가된 CSF 수준은 PBMC에서 FAAH의 활성 및 단백질 함량 감소와 관련이 있었으며 이는 증가된 AEA 톤을 나타냅니다. AEA 수치는 CSF와 정신분열증 환자의 혈액에서 상승했으며, AEA 혈액 수치와 PBMCs에서 CB2 및 FAAH의 mRNA 전사물은 임상적 완화 후 유의하게 감소했습니다.

이 연구의 목적은 편두통이 있는 피험자에서 ES 활동의 특정 기능적 패턴을 확인하는 것이었습니다. 이를 위해 조사관은 조짐이 없는 EM, CM-MO 및 건강한 대조군(CT)을 가진 피험자의 대표 샘플 PBMC에서 ES의 여러 주변 구성 요소(유전자 발현, 단백질 발현 및 DNA 메틸화)를 철저히 평가했습니다.

EM 환자 25명, CM-MO 환자 26명, CT 환자 24명이 IRCCS Mondino Foundation of Pavia(이탈리아)의 두통 센터에 등록되었습니다. 이 연구는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았으며 등록된 모든 피험자는 서면 동의서에 서명했습니다.

혈액 샘플(20ml)은 참여자로부터 튜브를 포함하는 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA) 내에서 수집되었습니다. 혈액 샘플을 인산염 완충 식염수 1X(PBS 1X)(Sigma)와 1:1 비율로 희석했습니다. 희석된 혈액 샘플을 Ficoll 분리 용액(15ml)(Sigma)에 천천히 로딩하고 실온에서 30분 동안 브레이크 없이 800g에서 원심분리했습니다. 중간 흰색 단층으로 축적된 PBMC를 멸균 PBS 1X에서 2회 세척하고 300g에서 15분 동안 원심분리했습니다. 각 샘플에 대해 PBMC 배치는 RNA 또는 DNA 추출에 사용되었고 다른 하나는 유동 세포 분석기 분석에 사용되었습니다.

3개 연구 그룹의 피험자로부터 분리된 PBMC에서 연구자는 다음을 분석했습니다.

• CB1 및 CB2 단백질 발현;
• 다음 유전자의 발현: CB 수용체, FAAH, NAPE-PLD, MAGL 및 DAGL
• ES 구성 요소의 DNA 메틸화. PBMC에서 CB1 및 CB2 단백질 발현의 상대적 수준을 결정하기 위해 연구자들은 FACS Canto 유세포 분석기(Becton-Dickenson)를 사용하여 유세포 분석기를 사용했습니다. 분리 후, CD45(BD Biosciences, 1:50), CB1(R&D 시스템, 1:50) 및 CB2 수용체(Cayman Chemical, 1:30)에 대한 항체를 사용하여 세포(반응당 100,000개)를 염색했습니다. 총 10000개의 이벤트가 CB1 및 CB2와 CD45 염색의 교차점에 대해 게이팅된 창에서 계산되었습니다.

표준 절차(Zymo Research)를 사용하여 PBMC로부터 총 RNA를 분리하고 나노드롭 분광광도계(Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 RNA 품질을 평가했습니다. 공급업체의 지침에 따라 iScript cDNA 합성 키트(Biorad)를 사용하여 cDNA를 생성했습니다. Fast Eva Green supermix(BIO-RAD)를 사용하여 CB 수용체, FAAH, NAPE-PLD, MAGL 및 DAGL의 유전자 발현을 분석했습니다. 모든 실험군에서 발현이 일정하게 유지되는 유비퀴틴(UBC)을 하우스키핑 유전자로 사용하였다. 공급업체의 지침에 따라 Light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System(Roche)을 사용하여 증폭을 수행했습니다. 모든 샘플을 3회 분석하고 Ct 값을 사용하여 2-ΔCt = 2-(Ct 유전자 - Ct 하우스키핑 유전자) 공식에 따라 유전자 발현 수준을 계산했습니다.

PBMC는 뉴런 및 말초 유핵 세포를 포함하여 대부분의 조직에서 발견되는 후성유전학적 효소의 완전한 보완물을 함유하고 있기 때문에 조사자들은 등록된 모든 피험자의 ES 유전자 전사 조절에서 DNA 메틸화의 역할을 평가했습니다.

QIAmp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 전혈에서 DNA를 추출하고 NanoDrop 정량화(NanoDrop Techologies, Thermofisher)로 농도를 결정했습니다. 어레이 준비 및 데이터 분석은 Genomix4Life srl(이탈리아 Baronissi)에서 수행했습니다. 고품질 DNA(500ng)는 EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research, Irvine, CA, USA)를 사용하여 bisulfite로 변환되었습니다. 21,231(99%) RefSeq 유전자를 포함하는 485,577개의 프로브를 포함하는 HumanMethylation 450K BeadChip(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 Bisulfite 변환된 DNA(200ng)를 전체 게놈 메틸화 분석에 사용했습니다. 간단히 말해서, 바이설파이트 변환된 DNA를 20시간 동안 전체 게놈 증폭한 후 종점 단편화를 수행했습니다. 단편화된 DNA를 침전시키고, 변성시키고, 48℃에서 20시간 동안 BeadChips에 혼성화시켰다. Illumina iScan 시스템을 사용하여 BeadChip을 스캐닝하기 전에 BeadChip을 세척하고 혼성화된 프라이머를 연장하고 라벨링했습니다. GenomeStudio 소프트웨어(버전 2011.1; Illumina Inc.)는 스캔된 어레이에서 DNA 메틸화 신호를 추출하는 데 사용되었습니다. 각 시토신에 대한 메틸화 수준은 프로브의 메틸화 버전과 비메틸화 버전의 형광 강도 비율로 계산된 베타 값으로 표현되었습니다. 베타 값 범위는 0(비메틸화)과 1(메틸화) 사이였습니다. CGI와 관련된 주석은 다음과 같은 분류를 사용합니다. 'shore', CGI 옆에 있는 각 2kb 시퀀스 '선반', 해안 옆에 있는 각각의 2kb 시퀀스; 'open sea', 이전 서열이나 CGIs 4에 포함되지 않은 DNA. TSS200과 TSS1500은 각각 TSS에서 위치 -200 bp와 -1500 bp 사이의 영역을 나타냅니다. 주어진 두 유전자좌 사이의 중요한 메틸화 차이는 델타-베타 값으로 표시되며 DiffScores(DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0.001) = 저메틸화; DiffScore⩾30.0 (≈ p val<0.001) = 과메틸화).