Endokannabinoidijärjestelmän geeniekspressio episodisissa ja kroonisissa migreenipotilaissa

Migreeni on neurovaskulaarinen sairaus, jonka patofysiologiaa ei ole läheskään täysin selvitetty. Tämä johtuu pääasiassa monimutkaisista mekanismeista, jotka ovat migreenikohtauksen ja sen uusiutumisen taustalla. Endokannabinoidijärjestelmä (ES) on monimutkainen signalointijärjestelmä, joka osallistuu erilaisiin biologisiin prosesseihin (esim. hermoston aktiivisuus, kiputuntemukset ja immuunitoiminnot) ja sillä on ratkaiseva rooli kehon homeostaasin ylläpitämisessä. ES-komponentit sisältävät endogeeniset lipidit, joista eniten tutkitut ovat N-arakidonoyylietanolamidi (AEA) ja 2-arakidonoyyliglyseroli (2-AG), niiden metaboliset entsyymit ja vähintään kaksi kannabinoidireseptoria (CB1 ja CB2). AEA:n biosynteesi tapahtuu pääasiassa N-asyylifosfatidyylietanolamidifosfolipaasi D:n (NAPE-PLD) vaikutuksesta, kun taas 2-AG:ta tuotetaan diasyyliglyserolilipaasin (DAGL) vaikutuksesta. AEA metaboloituu rasvahappoamidihydrolaasilla (FAAH) ja 2-AG:lla pääasiassa monoasyyliglyserolilipaasin (MAGL) vaikutuksesta.

Muutokset ES-komponenttien geeniekspressiossa voivat sisältää erilaisia ​​solutyyppejä, useita katabolisia reittejä ja aktiivisten metaboliittien muodostumista epigeneettisten mekanismien kautta sekä fysiologisissa että patologisissa olosuhteissa. CB-geenit voivat esimerkiksi olla vuorovaikutuksessa erilaisten transkriptiotekijöiden kanssa, joista monet liittyvät DNA:n metylaatioon ja histonin translaation jälkeisiin modifikaatioihin. Toimimaton ES on liitetty lukuisiin sairauksiin, mukaan lukien migreeni. ES todellakin moduloi useita aktiviteetteja ja neuromodulaattoreita/välittäjäaineita, joilla on ratkaiseva rooli migreenin patogeneesissä. ES on myös osallisena aivorungon afferenteista tulevan trigeminovaskulaarisen nosiseptiivisen transmission laskevassa modulaatiossa. Aiemmat tutkimukset Integratiivisten autonomisten järjestelmien neurofysiologian laboratoriosta, Headache Science Centre, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Italia) käyttäen migreenispesifistä eläinmallia, joka perustuu nitroglyseriinin antamiseen rotille, osoittivat vuorovaikutuksen olemassaolon ES:n ja kivun välityksen välillä. . Erityisesti tutkijat osoittivat AEA:n ja FAAH:n säätelemän AEA-toiminnan keskeisen roolin kolmoishermoston nosiseptiivisten signaalien käsittelyssä. AEA estää neurogeenista kovakalvon vasodilataatiota sekä kalsitoniinigeeniin liittyvää peptidi-indusoitua ja typpioksidin aiheuttamaa kovakalvon suonen laajentumista, jotka CB1-antagonismi kumoaa. Kliiniset havainnot viittaavat myös ES:n ja migreenikivun väliseen vuorovaikutukseen. FAAH-aktiivisuus oli korkeampi episodista migreeniä (EM) sairastavien naisten verihiutaleissa, mikä viittaa AEA:n selvempään hajoamiseen. Koehenkilöillä, joilla oli krooninen migreeni (CM) ja lääkkeiden liikakäyttö (MO), havaittiin muuttunutta endokannabinoidiaineenvaihduntaa ei vain verihiutaleissa, vaan myös aivo-selkäydinnesteessä. Vaikka edellä mainitut kliiniset löydökset ovat hajallaan ja toistuvat, niiden uudelleenarviointi lisääntyvistä esikliinisistä todisteista saadun uudemman tiedon valossa saa aikaan tarpeen tutkia syvällisemmin ES:n roolia migreenin patofysiologiassa.

Useat tutkimukset viittaavat siihen, että perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) havaitut muutokset ES-komponenteissa ovat luotettavia indikaattoreita ES:n keskeisestä toimintahäiriöstä erilaisissa neurologisissa sairauksissa. Esimerkiksi Parkinsonin tautia tai multippeliskleroosia sairastavilla potilailla AEA:n kohonneet CSF-tasot liittyivät FAAH:n aktiivisuuden ja proteiinipitoisuuden vähenemiseen PBMC:issä, mikä on osoitus kohonneesta AEA-äänestä. AEA-tasot kohonivat skitsofreenisten koehenkilöiden aivo-selkäydinnesteessä ja veressä, ja AEA-veren tasot sekä CB2:n ja FAAH:n mRNA-transkriptit laskivat merkittävästi PBMC:issä kliinisen remission jälkeen.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa ES-aktiivisuuden spesifisiä toiminnallisia malleja migreenipotilailla. Tätä varten tutkijat suorittivat perusteellisen arvioinnin ES:n useista perifeerisistä komponenteista (geenin ilmentyminen, proteiinin ilmentyminen ja DNA:n metylaatio) PBMC-soluissa edustavista näytteistä koehenkilöistä, joilla oli EM ilman auraa, CM-MO ja terveissä kontrolleissa (CT).

25 potilasta, joilla oli EM, 26 CM-MO ja 24 CT, otettiin mukaan IRCCS Mondino Foundation of Pavia (Italia) päänsärkykeskukseen. Paikallinen eettinen komitea hyväksyi tutkimuksen, ja kaikki tutkimushenkilöt allekirjoittivat kirjallisen tietoisen suostumuksen.

Verinäytteet (20 ml) kerättiin osallistujilta etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) sisältäviin putkiin. Verinäytteet laimennettiin suhteessa 1:1 fosfaattipuskurisuolaliuoksella 1X (PBS 1X) (Sigma). Laimennetut verinäytteet ladattiin hitaasti Ficoll-erotusliuokseen (15 ml) (Sigma) ja sentrifugoitiin 800 g ilman jarrua 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Keskimmäisenä valkoisena yksikerroksena kerääntyneet PBMC:t pestiin kahdesti steriilissä PBS:ssä 1X ja sentrifugoitiin 300 g:ssä 15 minuuttia. Jokaiselle näytteelle käytettiin erää PBMC:itä RNA- tai DNA-uuttoon ja toista virtaussytometrianalyysiin.

Kolmen tutkimusryhmän kohteista eristetyissä PBMC:issä tutkijat määrittelivät:

• CB1- ja CB2-proteiinin ilmentyminen;
• seuraavien geenien ilmentyminen: CB-reseptorit, FAAH, NAPE-PLD, MAGL ja DAGL
• ES-komponenttien DNA-metylaatio. CB1- ja CB2-proteiinin ilmentymisen suhteellisen tason määrittämiseksi PBMC-soluissa tutkijat käyttivät virtaussytometriaa FACS Canto -virtaussytometrillä (Becton-Dickenson). Eristyksen jälkeen solut (100 000 per reaktio) värjättiin käyttämällä vasta-aineita CD45:tä (BD Biosciences, 1:50), CB1:tä (R&D-järjestelmä, 1:50) ja CB2-reseptoreita (Cayman Chemical, 1:30) vastaan; yhteensä 10 000 tapahtumaa laskettiin ikkunoissa, jotka oli suojattu CD45-värjäyksen ja CB1:n ja CB2:n risteyskohdassa.

Kokonais-RNA PBMC:istä eristettiin käyttämällä standardimenettelyä (Zymo Research) ja RNA:n laatu arvioitiin käyttämällä nanodrop-spektrofotometriä (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); cDNA luotiin käyttämällä iScript cDNA Synthesis -pakkausta (Biorad) noudattaen toimittajan ohjeita. CB-reseptorien, FAAH:n, NAPE-PLD:n, MAGL:n ja DAGL:n geeniekspressio analysoitiin käyttämällä Fast Eva Green supermixiä (BIO-RAD). Ubikitiiniä (UBC), jonka ilmentyminen pysyi vakiona kaikissa koeryhmissä, käytettiin taloudenhoitogeeninä. Monistaminen suoritettiin kevyellä Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System -laitteella (Roche) noudattaen toimittajan ohjeita. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena rinnakkaisena ja geenin ilmentymistasot laskettiin 2-∆Ct = 2- (Ct-geeni - Ct-talousgeeni) -kaavan mukaan käyttämällä Ct-arvoja.

Koska PBMC:t sisältävät täyden komplementin epigeneettisiä entsyymejä, joita löytyy useimmista kudoksista, mukaan lukien hermosolut ja perifeeriset tumalliset solut, tutkijat arvioivat DNA-metylaation roolin ES-geenin transkription säätelyssä kaikissa tutkimukseen osallistuneissa koehenkilöissä.

DNA uutettiin kokoverestä käyttämällä QIAmp DNA Blood Mini Kitiä (Qiagen) ja sen pitoisuus määritettiin NanoDrop-kvantifioinnilla (NanoDrop Techologies, Thermofisher). Array-valmistelun ja data-analyysin suoritti Genomix4Life srl (Baronissi, Italia). Korkealaatuinen DNA (500 ng) muunnettiin bisulfiitilla käyttämällä EZ DNA -metylaatiosarjaa (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfiitilla muunnettua DNA:ta (200 ng) käytettiin koko genomin metylaation analysointiin käyttäen HumanMethylation 450 K BeadChipiä (Illumina, San Diego, CA, USA), joka sisältää 485 577 koetinta, jotka kattavat 21 231 (99 %) RefSeq-geeniä. Lyhyesti sanottuna bisulfiitilla muunnettua DNA:ta monistettiin koko genomiksi 20 tunnin ajan, mitä seurasi päätepistefragmentointi. Fragmentoitu DNA saostettiin, denaturoitiin ja hybridisoitiin BeadChipsiin 20 tunnin ajan 48 °C:ssa. BeadChipsit pestiin ja hybridisoidut alukkeet pidennettiin ja leimattiin ennen BeadChipsien skannausta Illumina iScan -järjestelmällä. GenomeStudio-ohjelmisto (versio 2011.1; Illumina Inc.) käytettiin DNA-metylaatiosignaalien erottamiseen skannatuista ryhmistä. Kunkin sytosiinin metylaatiotaso ilmaistiin beeta-arvona, joka laskettiin koettimien metyloituneiden ja metyloitumattomien versioiden fluoresenssin intensiteetin suhteena: beeta-arvot vaihtelivat välillä 0 (metyloitumaton) ja 1 (metyloitu). CGI:itä koskevassa huomautuksessa käytetään seuraavaa luokittelua: "ranta", jokainen 2 kb:n sekvenssi reunustaa CGI:tä; 'hylly', jokainen 2 kb:n sekvenssi rannan vieressä; "avomeri", DNA ei sisälly mihinkään edellisiin sekvensseihin tai CGI:ihin 4. TSS200 ja TSS1500 osoittavat alueen -200 bp ja -1500 bp välillä TSS:stä, vastaavasti. Merkittävä metylaatioero kahden tietyn lokuksen välillä ilmaistaan ​​delta-beta-arvolla ja määritetään GenomeStudio Methylation Module -sovelluksella käyttämällä Illumina mukautettua algoritmia DiffScore-arvojen laskemiseen (DiffScore⩽-30.0). (≈ pval < 0,001) = hypometylaatio; DiffScore⩾30.0 (≈ p val < 0,001) = hypermetylaatio).