Genexpressie van het endocannabinoïdesysteem bij patiënten met episodische en chronische migraine

Migraine is een neurovasculaire aandoening waarvan de pathofysiologie nog lang niet volledig opgehelderd is. Dit is voornamelijk te wijten aan de complexe mechanismen die ten grondslag liggen aan een migraineaanval en aan de herhaling ervan. Het endocannabinoïdesysteem (ES) is een complex signaalsysteem dat betrokken is bij verschillende biologische processen (bijv. neuronale activiteit, pijnsensatie en immuunfuncties) en het speelt een cruciale rol bij het handhaven van de lichaamshomeostase. De ES-componenten omvatten de endogene lipiden, de meest bestudeerde daarvan zijn N-arachidonoylethanolamide (AEA) en 2-arachidonoylglycerol (2-AG), hun metabolische enzymen en ten minste twee cannabinoïde-receptoren (CB1 en CB2). De biosynthese van AEA vindt voornamelijk plaats door N-acylfosfatidylethanolamide-fosfolipase D (NAPE-PLD), terwijl 2-AG wordt geproduceerd door de werking van diacylglycerol lipase (DAGL). AEA wordt gemetaboliseerd door vetzuuramidehydrolase (FAAH) en 2-AG voornamelijk door monoacylglycerol lipase (MAGL).

Veranderingen in genexpressie van ES-componenten kunnen betrekking hebben op verschillende celtypen, meerdere katabole routes en het genereren van actieve metabolieten via epigenetische mechanismen, onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. CB-genen kunnen bijvoorbeeld interageren met verschillende transcriptionele factoren, waarvan er vele verband houden met DNA-methylatie en histon post-translationele modificaties. Een disfunctionele ES is in verband gebracht met tal van aandoeningen, waaronder migraine. De ES moduleert inderdaad meerdere activiteiten en neuromodulatoren/neurotransmitters die een cruciale rol spelen bij de pathogenese van migraine. ES is ook betrokken bij de dalende modulatie van de trigeminovasculaire nociceptieve transmissie vanuit de afferenten van de hersenstam. Eerdere studies van het Laboratory of Neurophysiology of Integrative Autonomic Systems, Headache Science Centre, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Italië), waarbij gebruik werd gemaakt van het migrainespecifieke diermodel op basis van nitroglycerinetoediening bij ratten, toonden het bestaan ​​aan van interacties tussen de ES en pijnbemiddeling . In het bijzonder toonden de onderzoekers een sleutelrol aan voor AEA en voor FAAH-gereguleerde AEA-activiteit bij de verwerking van trigeminale nociceptieve signalen. AEA remt neurogene durale vasodilatatie, evenals calcitonine-gen-gerelateerde peptide-geïnduceerde en stikstofmonoxide-geïnduceerde durale vaatverwijding, een activiteit die wordt omgekeerd door CB1-antagonisme. De interactie tussen de ES en migrainepijn wordt ook gesuggereerd door klinische observaties. De FAAH-activiteit was hoger in bloedplaatjes van vrouwen met episodische migraine (EM), wat wijst op een meer uitgesproken afbraak van AEA. Proefpersonen met chronische migraine (CM) en overmatig gebruik van medicatie (MO) vertoonden een veranderd endocannabinoïdemetabolisme, niet alleen in de bloedplaatjes, maar ook in het CSF. Hoewel de bovenstaande klinische bevindingen verspreid en herhaald zijn, roept hun heroverweging in het licht van recentere gegevens uit het toenemende preklinische bewijs de noodzaak op om de rol van ES in de pathofysiologie van migraine grondiger te onderzoeken.

Verschillende onderzoeken suggereren dat veranderingen in ES-componenten die worden gedetecteerd in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) betrouwbare indicatoren zijn van een centrale disfunctie van de ES bij verschillende neurologische aandoeningen. Bij patiënten met de ziekte van Parkinson of multiple sclerose werden bijvoorbeeld verhoogde CSF-niveaus van AEA geassocieerd met een vermindering van de activiteit en het eiwitgehalte van FAAH in PBMC's, wat een indicatie is van een verhoogde AEA-toon. AEA-spiegels waren verhoogd in het CSF en in het bloed van schizofrene proefpersonen, met een significante daling van de AEA-bloedspiegels en in mRNA-transcripten van CB2 en FAAH in PBMC's na klinische remissie.

Het doel van deze studie was de identificatie van specifieke functionele patronen van ES-activiteit bij personen met migraine. Daartoe voerden de onderzoekers een grondige evaluatie uit van meerdere perifere componenten van de ES (genexpressie, eiwitexpressie en DNA-methylatie) in PBMC's van representatieve monsters van proefpersonen met EM zonder aura, CM-MO en in gezonde controles (CT).

Vijfentwintig proefpersonen met EM, 26 met CM-MO en 24 CT waren ingeschreven in het hoofdpijncentrum van de IRCCS Mondino Foundation in Pavia (Italië). De studie werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie en alle ingeschreven proefpersonen ondertekenden een schriftelijke geïnformeerde toestemming.

Bloedmonsters (20 ml) werden verzameld in buisjes met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) van deelnemers. Bloedmonsters werden verdund in een verhouding van 1:1 met fosfaatbuffer zoutoplossing 1X (PBS 1X) (Sigma). Verdunde bloedmonsters werden langzaam op Ficoll-scheidingsoplossing (15 ml) (Sigma) geladen en bij 800 g zonder rem gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd. PBMC's verzamelden zich als de middelste witte monolaag, werden tweemaal gewassen in steriel PBS 1X en 15 minuten gecentrifugeerd bij 300 g. Voor elk monster werd een batch PBMC's gebruikt voor RNA- of DNA-extractie en een andere voor flowcytometeranalyse.

In de PBMC's geïsoleerd van de proefpersonen in de 3 studiegroepen testten de onderzoekers:

• CB1- en CB2-eiwitexpressie;
• expressie van de volgende genen: CB-receptoren, FAAH, NAPE-PLD, MAGL en DAGL
• DNA-methylering van ES-componenten. Om het relatieve niveau van CB1- en CB2-eiwitexpressie in PBMC's te bepalen, gebruikten de onderzoekers flow-cytometrie met een FACS Canto flow-cytometer (Becton-Dickenson). Na isolatie werden cellen (100.000 per reactie) gekleurd met behulp van antilichamen tegen CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (R&D-systeem, 1:50) en CB2-receptoren (Cayman Chemical, 1:30); in totaal werden 10.000 gebeurtenissen geteld in vensters die waren afgesloten voor de kruising van CD45-kleuring met CB1 en CB2.

Totaal RNA van PBMC's werd geïsoleerd met behulp van de standaardprocedure (Zymo Research) en de RNA-kwaliteit werd beoordeeld met behulp van een nanodrop-spectrofotometer (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); cDNA werd gegenereerd met behulp van de iScript cDNA Synthesis-kit (Biorad) volgens de instructies van de leverancier. Genexpressie van CB-receptoren, FAAH, NAPE-PLD, MAGL en DAGL werd geanalyseerd met behulp van de Fast Eva Green supermix (BIO-RAD). Ubiquitine (UBC), waarvan de expressie constant bleef in alle experimentele groepen, werd gebruikt als huishoudgen. De amplificatie werd uitgevoerd met een light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) volgens de instructies van de leverancier. Alle monsters werden in drievoud getest en genexpressieniveaus werden berekend volgens de formule 2-∆Ct = 2- (Ct-gen - Ct-huishoudingsgen) door Ct-waarden te gebruiken.

Aangezien PBMC's de volledige aanvulling van epigenetische enzymen bevatten die in de meeste weefsels worden aangetroffen, inclusief neuronen en perifere kerncellen, evalueerden de onderzoekers de rol van DNA-methylatie bij de regulatie van ES-gentranscriptie bij alle ingeschreven proefpersonen.

DNA werd geëxtraheerd uit volbloed met behulp van QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) en de concentratie ervan werd bepaald door NanoDrop-kwantificering (NanoDrop Techologies, Thermofisher). Arrays-voorbereiding en gegevensanalyse werden uitgevoerd door Genomix4Life srl (Baronissi, Italië). Hoogwaardig DNA (500 ng) werd in bisulfiet omgezet met behulp van de EZ DNA-methylatiekit (Zymo Research, Irvine, CA, VS). Bisulfiet-geconverteerd DNA (200 ng) werd gebruikt voor analyse van methylering van het hele genoom, met behulp van de HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, VS), die 485 577-sondes bevat die 21 231 (99%) RefSeq-genen omvatten. Kortom, bisulfiet-geconverteerd DNA werd gedurende 20 uur in het hele genoom geamplificeerd, gevolgd door eindpuntfragmentatie. Gefragmenteerd DNA werd geprecipiteerd, gedenatureerd en gehybridiseerd met de BeadChips gedurende 20 uur bij 48 °C. De BeadChips werden gewassen en de gehybridiseerde primers werden verlengd en gelabeld voordat de BeadChips werden gescand met behulp van het Illumina iScan-systeem. GenomeStudio-software (versie 2011.1; Illumina Inc.) werd gebruikt voor de extractie van DNA-methyleringssignalen uit gescande arrays. Het methylatieniveau voor elke cytosine werd uitgedrukt als een bètawaarde berekend als de fluorescentie-intensiteitsverhouding van de gemethyleerde tot niet-gemethyleerde versies van de probes: bètawaarden varieerden tussen 0 (niet-gemethyleerd) en 1 (gemethyleerd). De annotatie met betrekking tot CGI's gebruikt de volgende indeling: 'shore', elk van de reeksen van 2 kb die een CGI flankeren; 'plank', elk van de reeksen van 2 kb naast een oever; 'open zee', DNA dat niet is opgenomen in een van de voorgaande sequenties of in CGI's 4. TSS200 en TSS1500 geven het gebied aan tussen respectievelijk positie -200 bp en -1500 bp van de TSS. Het significante methylatieverschil tussen twee gegeven loci wordt aangegeven door een delta-beta-waarde en bepaald met GenomeStudio Methylation Module met behulp van het aangepaste Illumina-algoritme voor het berekenen van DiffScores (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0,001)=hypomethylering; DiffScore⩾30.0 (≈ p val<0,001)=hypermethylering).