COVID-19 に対する免疫反応;治療薬およびワクチン用の中和抗体の分離。 (AcNT-COVID19)

ルリール パー パスカル ポワニャール

1. 病理学に関する現在の知識

   コロナウイルスは、そのメンバーが上皮に対する向性を共有する大きなファミリーです。 それらは通常、気道の急性および限定的な炎症を伴う、ヒトにおける通常の頻繁な感染の原因です。 それらが RNA ウイルス (重要な可塑性を与える) であり、動物に感染するタイプと人に感染するタイプがあるという事実は、それらが動物株から生じる新しいヒト疾患の原因である可能性があることを説明しています。 これが、過去数年間にいくつかの国で広がった2つのコロナウイルスのアウトブレイクがどのように発生したかです.2003年の重症急性呼吸器症候群（SARS）。そして2012年の中東呼吸器症候群（MERS）。 2020 年 1 月には、SARS-CoV-2 に関連する COVID-19 の発生という別のコロナウイルスの発生が報告されました。

   コロナウイルス病 2019 (COVID-19) として言及されている病気は、2019 年 12 月に中国で初めて検出されました。最初の症例クラスターは生きた動物の市場に強く関連しており、動物起源を示唆しています。以下の説明は、2.5 から 3.5 の間の再生産数 (R0) で、ヒトからヒトへの感染を明確に確立しました。 一部の科学出版物は、無症候性被験者による潜在的な汚染について説明しています。 中国は最終的に毎日の症例数の大幅な減少を記録することができましたが (2020 年 3 月 31 日に合計 82,241 症例、3,309 人が死亡)、流行は他の多くの国に急速に広がりました。 フランスでは、活発なウイルス循環のいくつかの場所 (ロワーズ、ミュルーズ、ラ オートサボア) が最終的にフランスでの流行の重要な発展につながりました (2020 年 3 月 31 日に 44,450 件の症例と 3,024 人の死亡者)。

   この疾患は、いくつかの側面で急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) を思い起こさせる肺炎で構成されています。潜伏期間の中央値 5 日間の後、症状は発熱性/発熱性であり、呼吸困難に発展/発展する可能性があり、場合によっては 7 ～ 10 日間の発展後に ARDS に向かう可能性がある咳で発症します。 最初の疫学的記述で重症例の割合が高い (33% 以上) と述べられていた場合、70,000 例を超える症例を含む研究では、15% の症例が重症/顕著なものであり、5% が重症であることが示唆されました。ただし、新しい研究によると、無症候性またはほとんど症状のないケースが多数ある可能性があります。 今日まで、治癒的な抗ウイルス治療は臨床効果を示していませんが、多くの臨床試験が進行中です。 この病気は、2 つの理由で医療制度の問題となっています。伝染性 (大規模な社会的距離をとる手段が必要) と罹患率 (ICU への入院が多すぎるため、医療制度を麻痺させる) です。

2. COVID-19 最先端技術における免疫応答:

   したがって、この研究の主な目的は、SARS-CoV-2感染における抗体反応を調査し、治療およびワクチン使用のための中和モノクローナル抗体を詳細に特定して生成することです。

   SARS 感染患者では、抗体反応は通常、最初の症状から 2 週間以内に現れ、病気が始まってから少なくとも 16 か月間持続します。 中和反応も早期に現れますが、16 か月後には急速に弱まる傾向があります。 興味深いことに、SARS-CoV を標的とする抗体は SARS-CoV-2 を中和できることが示されており、中和抗体の存在が示唆されています (3)。 これは、中和抗体の標的である糖タンパク質を包む 2 つのウイルス間の比較的高い保存性 (約 77% の配列相同性、非常に類似した構造、および同じ細胞受容体 ACE2 の使用) によって説明できます。 MERS-CoV 感染時には、抗体反応が感染の 2 週目に現れ、少なくとも 18 か月間持続することも示されています。 抗 MERS-CoV に対する中和反応が報告されています。患者のウイルス量は中和抗体レベルに反比例します。 これらの中和抗体だけでは、感染のクリアランスには不十分です (4)。 興味深いことに、OC43 や 229E などの他のコロナウイルスに対する防御抗体応答は、時間的にはるかに限られているようです (5)。

   COVID-19 中の抗体反応、特に中和活性の特徴付けは、それが可能にする進歩にとって重要です。

   • SARS-CoV-2 による感染中および感染後の潜在的に保護的な体液性反応の性質と期間を理解する
   • SARS-CoV-2 表面糖タンパク質、特にスパイクタンパク質 (SARS2-S) に対する IgM および IgG 抗体応答の進化を研究する
   • 中和抗体応答の進化を研究する。 実際、この応答が感染の重症度と期間に応じて変化する場合、強力な体液性免疫がすべての感染患者でどの程度生成されるかをよりよく理解することが不可欠です.
   • 患者の血清をスクリーニングして、高い中和力価を示す個人を探し、おそらくさまざまなコロナウイルスに対する中和抗体を探します。 一部の患者がさまざまなコロナウイルスを中和できる中和抗体を産生できるかどうかを理解することが不可欠です。
   • 抗体による潜在的なウイルス感染促進の存在を研究すること。 実際、抗体によって媒介される感染力の増加は、他のコロナウイルスについても報告されており、ワクチンの開発はより困難になる可能性があります (6)。

   この特徴付けに続いて、研究者は選択された患者からヒトモノクローナル抗体を分離することができます。 抗体の分離は、COVID-19 だけでなく、他の既存のコロナウイルス感染症、または新しいコロナウイルスの発生の場合に治療および予防するために、将来の治療およびワクチンアプローチを特に可能にする可能性があります。

   したがって、最も有望なモノクローナル抗体 (高親和性、高中和能力) が選択され、治療薬 (リード化合物) としての将来の開発のために最適化されます。

   うまくいけば、研究者は、単離されたモノクローナル抗体を構造的アプローチのツールとして使用して、中和エピトープを決定し、ワクチン アプローチ (リバース ワクチン学) を開発することができます。

   目的の体液性応答について選択された個人からヒトモノクローナル抗体を分離するために、選択された標的に対する抗体を表面に持つ特定の IgG 陽性メモリー B 細胞をフローサイトメトリーで選別します。 このプロジェクトの一環として、蛍光色素標識ストレプトアビジンに結合した SARS-2-S ビオチン化組換えタンパク質を認識する抗体を産生する B 細胞が選別されます。 これらのタンパク質は、293F細胞のトランスフェクションによって産生され、その後精製されます。 別の戦略は、例えばSARS-2-Sで偽型化されたウイルスの使用を含むマイクロ中和アッセイにおいて、B細胞を活性化し、特定の中和抗体の存在について上清をスクリーニングすることからなる。 特定の B 細胞を識別した後、目的の免疫グロブリン遺伝子は、以前に HIV に対する抗体の分離に使用された方法 (7- 10)。

   増幅された重鎖および軽鎖は、続いて相同組換えによって発現ベクターにクローニングされる。 対応する抗体は、重鎖と軽鎖の適切な組み合わせによる 293F 細胞トランスフェクションによって生成されます。 SARS-2-S タンパク質に対する精製および反応性試験の後、中和機能を評価して、リード化合物を特定するためのより深い特性評価の候補を特定し、優先順位を付けます。

3. バイオマーカー:

   さらに、研究者は、予後不良の予測バイオマーカーを特定することを目的として、他の免疫プレーヤー、免疫細胞、補体、およびサイトカインを調査することを目指しています。 これらのラボ分析は、予後不良を予測することができ、医療の適応に貢献する可能性があります。

   調査には以下が含まれます。

   • フローサイトメトリーによって研究された T、B、および NK リンパ球亜集団と単球 HLA-DR 亜集団。
   • 補体系の研究 (C3、C4、CH50 & CH50a)。
   • サイトカインの研究、特に患者の入院の 1、3、7 日目の IL-6 と IL-10 の測定。

4. 研究仮説と期待される結果研究者は、SARS-CoV-2 のエンベロープ糖タンパク質を標的とする抗体反応を監視し、SARS-CoV-2 を標的とする高力価の中和抗体で免疫反応を示す被験者を特定できるようになります。 これにより、患者のメモリー B リンパ球からモノクローナル抗体を分離し、治療やワクチンの目的で使用できるようになります。

   さらに、COVID-19 患者の免疫調査により、重症度と悪化しているバイオマーカーの特定が可能になります。

5. 研究の実施

選択は、すべての患者の医療記録に基づいて行われます。

• COVID-19 RT-PCRの診断結果が陽性だった人
• CHUGAでの入院が48時間未満で、感染による症状がある人。

その後、調査医が患者を臨床的に検査する包含訪問が続きます。

この医師は、包含基準と非包含基準を確認し、試験を患者に公開し、患者の非反対とサンプリングの同意を収集します (付録 2)。 続いて、ケア、研究、およびデータ収集に関連する生物学的試験が行われます (§7.3 を参照)。

フォローアップ来院 (3 日目から 30 日目までの 2 回目から 8 回目の来院) は、組み入れ後の 1 か月にわたって研究カレンダーで確立されたとおりに行われます。 調査医が患者を臨床的に検査し、看護師がケアと研究に関連する採血を行います（1、3、7日目にバイオマーカー、1、3、7、13日目、最終入院日）および臨床研究アシスタントデータ収集を行います。 血液サンプル (1 日目、13 日目、最後の入院日からの血清および末梢単核血球) は、この研究の主要な基準に必要なサンプルです。

患者がまだ入院している場合にのみ、7 日目以降の通院 (通院 5 ～ 8) が行われます。 つまり、入院期間の終了は、グループ A の研究の終了を確立します。

グループ b の患者には、オプションの訪問を行うことができます。 患者がCHUGAで定期的にフォローアップされ、研究に有用なサンプルの収集を可能にする採血を伴う訪問が予定されている場合、包含から2〜6か月後に発生します。