Иммунный ответ на COVID-19; Выделение нейтрализующих антител для терапии и вакцины. (AcNT-COVID19)

RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. СОВРЕМЕННЫЕ ЗНАНИЯ О ПАТОЛОГИИ

   Коронавирусы представляют собой большое семейство, члены которого имеют общий тропизм к эпителиям. Обычно они являются причиной обычных и частых инфекций у людей, острых и ограниченных воспалений дыхательных путей. Тот факт, что они представляют собой РНК-содержащие вирусы (что придает им важную пластичность) и то, что некоторые типы заражают животных, а другие заражают человека, объясняет, что они могут быть источником новых болезней человека, возникающих из штаммов животных. Так возникли две вспышки коронавируса, охватившие несколько стран за последние годы: тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) в 2003 году; и Ближневосточный респираторный синдром (MERS) в 2012 году. В январе 2020 года была описана еще одна вспышка коронавируса: вспышка COVID-19, связанная с SARS-CoV-2.

   Болезнь, упоминаемая как коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19), была впервые обнаружена в Китае в декабре 2019 года; первая группа случаев была тесно связана с рынком живых животных, что предполагает животное происхождение; следующие описания четко установили передачу от человека к человеку с числом репродукции (R0) между 2,5 и 3,5. В некоторых научных публикациях описывалось потенциальное заражение от бессимптомных субъектов. В то время как Китаю, наконец, удалось зафиксировать значительное снижение числа ежедневных случаев заболевания (всего 82 241 случай с 3309 смертельными исходами на 31 марта 2020 года), эпидемия быстро охватила многие другие страны. Во Франции несколько очагов активной циркуляции вируса (Уаза, Мюлуз, Верхняя Савойя) в конечном итоге привели к важному развитию эпидемии во Франции (44 450 случаев с 3024 смертельными исходами на 31 марта 2020 г.).

   Заболевание заключается в пневмонии, напоминающей острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) в нескольких аспектах; после 5-дневного среднего инкубационного периода развиваются симптомы с кашлем, который может быть фебрильным/лихорадочным, и который может эволюционировать/развиваться в сторону одышки и, в некоторых случаях, в сторону ОРДС после 7-10 дней развития. Если первые эпидемиологические описания указывали на высокую долю тяжелых случаев (более 33%), то исследование, включающее более 70 000 случаев, предполагало, что 15% случаев были тяжелыми/выраженными и 5% критическими; однако, согласно новым исследованиям, вполне вероятно, что бессимптомные или малосимптомные случаи могут быть многочисленными. На сегодняшний день ни одно лечебное противовирусное лечение не продемонстрировало клинической эффективности, но многие клинические испытания продолжаются. Это заболевание представляет собой проблему для системы здравоохранения по двум причинам: его заразность (которая требует серьезных мер социального дистанцирования) и его заболеваемость (которая парализует систему здравоохранения, требуя слишком большого количества госпитализаций в отделении интенсивной терапии).

2. ИММУННЫЕ ОТВЕТЫ НА COVID-19: СОСТОЯНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

   Таким образом, основной целью этого исследования является изучение реакции антител при инфекции SARS-CoV-2, а также точная идентификация, а затем получение нейтрализующих моноклональных антител для терапевтического и вакцинного применения.

   У пациентов, инфицированных атипичной пневмонией, гуморальные реакции появляются обычно рано, в течение двух недель после появления первых симптомов, и продолжаются не менее 16 месяцев после начала заболевания. Нейтрализующие реакции также проявляются рано, но, как правило, быстро ослабевают через 16 месяцев. Интересно, что было показано, что антитела, нацеленные на SARS-CoV, способны нейтрализовать SARS-CoV-2, что предполагает существование нейтрализующих антител (3). Это можно объяснить относительно высокой консервативностью гликопротеинов оболочки двух вирусов (около 77% гомологии последовательностей, очень похожей структуры и использования одного и того же клеточного рецептора ACE2), которые являются мишенями нейтрализующих антител. Во время инфекции MERS-CoV также было показано, что ответы антител появляются на второй неделе инфекции и продолжаются в течение не менее 18 месяцев. Описан нейтрализующий ответ анти-БВРС-КоВ: вирусная нагрузка пациентов обратно пропорциональна уровням нейтрализующих антител. Одних только нейтрализующих антител недостаточно для устранения инфекции (4). Интересно, что защитный ответ антител против других коронавирусов, таких как OC43 и 229E, кажется гораздо более ограниченным по времени (5).

   Характеристика реакции антител во время COVID-19, особенно нейтрализующей активности, важна для прогресса, который она позволит:

   • Чтобы понять характер и продолжительность потенциально защитной гуморальной реакции во время и после заражения SARS-CoV-2
   • Изучить эволюцию ответов антител IgM и IgG против поверхностных гликопротеинов SARS-CoV-2, особенно шиповидного белка (SARS2-S).
   • Изучить эволюцию реакций нейтрализующих антител. Действительно, важно лучше понять, в какой степени сильный гуморальный иммунитет вырабатывается у всех инфицированных пациентов, если этот ответ зависит от тяжести и продолжительности инфекции.
   • Для скрининга сыворотки пациентов в поисках лиц с высокими титрами нейтрализации и, возможно, на наличие нейтрализующих антител против различных коронавирусов. Важно понять, могут ли некоторые пациенты вырабатывать нейтрализующие антитела, способные нейтрализовать разные коронавирусы.
   • Изучить наличие потенциального облегчения вирусной инфекции антителами. Действительно, повышение инфекционности, опосредованное антителами, было описано для других коронавирусов, и разработка вакцины могла бы стать более сложной задачей (6).

   После этой характеристики исследователи смогут выделить моноклональные антитела человека у отдельных пациентов. Выделение антител может, в частности, сделать возможным применение терапевтических и вакцинных подходов в будущем для лечения и профилактики не только COVID-19, но и других уже существующих коронавирусных инфекций или в случае новой вспышки коронавируса.

   Таким образом, наиболее перспективные моноклональные антитела (высокая аффинность, высокая нейтрализующая способность) будут отобраны и оптимизированы для будущей разработки в качестве терапевтического агента (ведущие соединения).

   В конце концов, исследователи смогут использовать выделенные моноклональные антитела в качестве инструментов структурных подходов для определения нейтрализующих эпитопов и разработки вакцинных подходов (обратная вакцинология).

   Чтобы выделить человеческие моноклональные антитела у индивидуумов, отобранных по интересующей их гуморальной реакции, специфические IgG-положительные В-клетки памяти, несущие на своей поверхности антитела против выбранных мишеней, сортируют с помощью проточной цитометрии. В рамках этого проекта будут отсортированы В-клетки, продуцирующие антитела, распознающие биотинилированные рекомбинантные белки SARS-2-S, конъюгированные со стрептавидином, меченным флуорохромом. Эти белки получают путем трансфекции клеток 293F и затем очищают. Альтернативная стратегия заключается в активации В-клеток и скрининге супернатантов на наличие специфических нейтрализующих антител в анализах микронейтрализации, включающих, например, использование вирусов, псевдотипированных с помощью SARS-2-S. После идентификации специфических В-клеток интересующие гены иммуноглобулинов будут амплифицированы с помощью ПЦР из клональных клеток для идентификации тяжелой и легкой (лямбда или каппа) цепей в соответствии с методами, ранее использовавшимися для выделения антител против ВИЧ (7- 10).

   Затем амплифицированные тяжелые и легкие цепи клонируют в векторе экспрессии путем гомологичной рекомбинации. Соответствующие антитела получают путем трансфекции клеток 293F соответствующей комбинацией тяжелых и легких цепей. После очистки и тестирования реактивности в отношении белка SARS-2-S мы оценим нейтрализующую функцию, чтобы определить и определить приоритеты кандидатов для более глубокой характеристики с целью выявления ведущих соединений.

3. БИОМАРКЕРЫ:

   Кроме того, исследователи стремятся изучить других участников иммунитета, иммунные клетки, комплемент и цитокины, с целью выявления прогностических биомаркеров неблагоприятного прогноза. Эти лабораторные анализы могли бы предсказать неблагоприятный прогноз и способствовать адаптации медицинской помощи.

   Исследования будут включать:

   • Субпопуляцию Т-, В- и NK-лимфоцитов и субпопуляцию моноцитов HLA-DR изучали методом проточной цитометрии.
   • изучение системы комплемента (C3, C4, CH50 и CH50a).
   • исследование цитокинов и, в частности, измерение IL-6 и IL-10 в дни 1, 3 и 7 госпитализации пациента.

4. ГИПОТЕЗА ИССЛЕДОВАНИЯ И ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Исследователи смогут отслеживать реакцию антител, нацеленных на оболочечные гликопротеины SARS-CoV-2, и выявлять субъектов, проявляющих иммунный ответ с высокими титрами нейтрализующих антител, нацеленных на SARS-CoV-2. Это позволит выделить моноклональные антитела из В-лимфоцитов памяти пациентов для терапевтических и вакцинных целей.

   Кроме того, исследование иммунитета у пациентов с COVID-19 позволит определить тяжесть заболевания и биомаркеры ухудшения.

5. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выбор осуществляется на основании медицинской карты каждого пациента:

• у которых был положительный результат диагностики COVID-19 RT-PCR
• госпитализированных менее чем на 48 часов в CHUGA и у которых есть симптомы, вызванные инфекцией.

Затем следует ознакомительный визит, во время которого врач-исследователь проводит клинический осмотр пациента.

Этот врач проверяет критерии включения и невключения, знакомит пациента с исследованием и собирает согласие пациента на непротивление и выборку (Приложение 2). Затем следуют биологические тесты, связанные с уходом за больными, исследованиями и сбором данных (см. §7.3).

Последующие визиты (посещения со 2-го по 8-й с 3-го по 30-й день) происходят, как установлено в календаре исследования, в течение месяца после включения. Врач-исследователь проводит клинический осмотр пациента, затем медсестра делает забор крови, связанный с уходом и исследованием (биомаркеры на 1, 3 и 7 день и биологический сбор на 1, 3, 7, 13 день, последний день госпитализации), а ассистент клинического исследования занимается сбором данных. Образец крови (сыворотка и периферические мононуклеарные клетки крови с 1-го, 13-го дня, последнего дня госпитализации) являются образцами, необходимыми для основных критериев этого исследования.

Посещения после 7-го дня (посещения с 5 по 8) происходят только в том случае, если пациент все еще находится в больнице. Другими словами, окончание пребывания в стационаре означает окончание исследования для группы А.

Факультативный визит может иметь место для пациентов группы b. Это происходит через 2-6 месяцев после включения, когда пациент регулярно наблюдается в CHUGA и когда запланировано посещение для забора крови, что позволит собрать полезные образцы для исследования.