Imunitní reakce na COVID-19; Izolace neutralizačních protilátek pro terapii a vakcínu. (AcNT-COVID19)

OPAKOVAT PAR PASCAL POIGNARD

1. AKTUÁLNÍ POZNATKY O PATOLOGII

   Koronaviry jsou velká rodina, jejíž členové sdílejí tropismus pro epitel. Obvykle jsou zodpovědné za běžné a časté infekce u lidí s akutními a omezenými záněty dýchacích cest. Skutečnost, že se jedná o RNA viry (což jim propůjčuje důležitou plasticitu) a že některé typy infikují zvířata a jiné infikují člověka, vysvětluje, že mohou být zdrojem nových lidských onemocnění pocházejících ze zvířecích kmenů. Takto se v posledních letech objevila dvě ohniska koronaviru, která se šíří v několika zemích: The Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), v roce 2003; a blízkovýchodní respirační syndrom (MERS) v roce 2012. V lednu 2020 byla popsána další epidemie koronaviru: epidemie COVID-19 související s SARS-CoV-2.

   Onemocnění uvedené jako koronavirové onemocnění 2019 (COVID-19) bylo poprvé zjištěno v Číně v prosinci 2019; první případ se silně týkal trhu se živými zvířaty, což naznačuje živočišný původ; následující popisy jasně prokázaly přenos z člověka na člověka s reprodukčním číslem (RO) mezi 2,5 a 3,5. Některé vědecké publikace popisovaly potenciální kontaminaci asymptomatickými subjekty. Zatímco Číně se nakonec podařilo zaznamenat velký pokles počtu denních případů (celkem 82 241 případů s 3 309 úmrtími k 31. březnu 2020), epidemie rychle zasáhla mnoho dalších zemí. Ve Francii několik míst s aktivní cirkulací viru (l'Oise, Mylhúzy, Haute-Savoie) nakonec vedlo k důležitému rozvoji epidemie ve Francii (44 450 případů s 3 024 úmrtími 31. března 2020).

   Onemocnění spočívá v zápalu plic připomínající v několika aspektech syndrom akutní respirační tísně (ARDS); po 5 dnech střední inkubační doby se symptomy rozvinou s kašlem, který může být febrilní/horečka, a který se může vyvinout/rozvinout do dušnosti a v některých případech do ARDS po 7 až 10 dnech vývoje. Jestliže první epidemiologické popisy uváděly vysoký podíl závažných případů (více než 33 %), studie zahrnující více než 70 000 případů pak naznačila, že 15 % případů bylo závažných/značných a 5 % kritických; je však pravděpodobné, že asymptomatické nebo málo symptomatické případy mohou být podle nových studií četné. Dosud žádná kurativní antivirová léčba neprokázala klinickou účinnost, ale mnoho klinických studií probíhá. Tato nemoc je pro systém zdravotní péče problémem ze dvou důvodů: její nakažlivost (která vyžaduje velká sociální distancování) a nemocnost (která paralyzuje zdravotnický systém tím, že vyžaduje příliš mnoho hospitalizací na JIP).

2. IMUNITNÍ REAKCE VE STAVU UMĚNÍ COVID-19:

   Hlavním cílem této studie je proto prozkoumat protilátkové odpovědi u infekce SARS-CoV-2 a přesněji identifikovat a následně vyrobit neutralizující monoklonální protilátky pro terapeutické a vakcinační použití.

   U pacientů infikovaných SARS se protilátková odpověď objevuje obvykle brzy, během dvou týdnů po prvních příznacích a trvá nejméně 16 měsíců po začátku onemocnění. Neutralizační reakce se objevují také brzy, ale mají tendenci rychle ubývat po 16 měsících. Je zajímavé, že bylo prokázáno, že protilátky zacílené na SARS-CoV jsou schopny neutralizovat SARS-CoV-2, což naznačuje existenci neutralizačních protilátek (3). To by se dalo vysvětlit relativně vysokou konzervací mezi dvěma obalovými glykoproteiny virů (asi 77 % sekvenční homologie, velmi podobná struktura a použití stejného buněčného receptoru ACE2), které jsou cílem neutralizačních protilátek. Během infekce MERS-CoV se také ukázalo, že protilátková odpověď se objevuje ve druhém týdnu infekce a trvá nejméně 18 měsíců. Byla popsána neutralizační odezva anti-MERS-CoV: virová zátěž pacientů je nepřímo úměrná hladinám neutralizujících Ab. Samotné neutralizační protilátky nestačí k odstranění infekce (4). Je zajímavé, že ochranná protilátková odpověď proti jiným koronavirům, jako jsou OC43 a 229E, se zdá být časově mnohem omezenější (5).

   Charakterizace protilátkové odpovědi během COVID-19, zejména neutralizační aktivity, je důležitá pro pokrok, který umožní:

   • Pochopit povahu a trvání potenciálně ochranné humorální reakce během a po infekci SARS-CoV-2
   • Studovat vývoj odpovědí IgM a IgG protilátek proti povrchovým glykoproteinům SARS-CoV-2, zejména spike proteinu (SARS2-S)
   • Studovat evoluci neutralizačních protilátek. Je skutečně nezbytné lépe porozumět tomu, v jakém rozsahu se u všech infikovaných pacientů vytváří silná humorální imunita, pokud se tato reakce mění podle závažnosti a trvání infekce.
   • Pro screening sér pacientů hledajících jedince vykazující vysoké neutralizační titry a možná i neutralizující protilátky proti různým koronavirům. Je nezbytné pochopit, zda někteří pacienti mohou produkovat neutralizační protilátky, schopné neutralizovat různé koronaviry.
   • Studovat existenci možného usnadnění virové infekce protilátkami. Nárůst infekčnosti zprostředkovaný protilátkami byl skutečně popsán u jiných koronavirů a mohl by být vývoj vakcín náročnější (6).

   Po této charakterizaci budou výzkumníci schopni izolovat lidské monoklonální protilátky od vybraných pacientů. Izolace protilátek by mohla v budoucnu zejména umožnit terapeutické a vakcinační přístupy k léčbě a prevenci nejen COVID-19, ale i jiných již existujících koronavirových infekcí nebo v případě propuknutí nového koronaviru.

   Budou tak vybrány a optimalizovány nejslibnější monoklonální protilátky (vysoká afinita, vysoká neutralizační kapacita) pro budoucí vývoj jako terapeutické činidlo (hlavní sloučeniny).

   V neposlední řadě budou výzkumníci schopni použít izolované monoklonální protilátky jako nástroje ve strukturních přístupech pro stanovení neutralizačních epitopů a vývoj vakcinačních přístupů (reverzní vakcinologie).

   Aby se izolovaly lidské monoklonální protilátky u jedinců vybraných pro jejich humorální odezvu, o kterou je zájem, specifické IgG pozitivní paměťové B buňky nesoucí protilátky proti vybraným cílům na svém povrchu, jsou tříděny průtokovou cytometrií. V rámci tohoto projektu budou tříděny B buňky produkující protilátky rozpoznávající SARS-2-S biotinylované rekombinantní proteiny konjugované s fluorochromem značeným streptavidinem. Tyto proteiny jsou produkovány transfekcí buněk 293F a poté jsou purifikovány. Alternativní strategie spočívá v aktivaci B buněk a screeningu supernatantů na přítomnost specifických neutralizačních protilátek v mikroneutralizačních testech zahrnujících například použití virů pseudotypizovaných SARS-2-S. Po identifikaci specifických B lymfocytů budou imunoglobulinové geny zájmu amplifikovány pomocí PCR z klonální buňky za účelem identifikace těžkých a lehkých (lambda nebo kappa) řetězců, podle metod dříve používaných pro izolaci protilátek proti HIV (7- 10).

   Amplifikované těžké a lehké řetězce jsou následně klonovány v expresním vektoru homologní rekombinací. Odpovídající protilátky jsou produkovány buněčnou transfekcí 293F vhodnou kombinací těžkých a lehkých řetězců. Po čištění a testování reaktivity proti proteinu SARS-2-S vyhodnotíme neutralizační funkci, abychom identifikovali a upřednostnili kandidáty pro hlubší charakterizaci, abychom identifikovali hlavní sloučeniny.

3. BIOMARKERY:

   Kromě toho se výzkumníci zaměřují na zkoumání dalších hráčů imunity, imunitních buněk, komplementu a cytokinů, s cílem identifikovat prediktivní biomarkery se špatnou prognózou. Tyto laboratorní analýzy by mohly předpovědět špatnou prognózu a mohly by přispět k přizpůsobení lékařské péče.

   Vyšetřování bude zahrnovat:

   • Subpopulace T, B a NK lymfocytů a subpopulace monocytů HLA-DR studována průtokovou cytometrií.
   • studium komplementového systému (C3, C4, CH50 & CH50a).
   • studie cytokinů a zejména měření IL-6 a IL-10 ve dnech 1, 3 a 7 hospitalizace pacienta.

4. HYPOTÉZA VÝZKUMU A OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY Vyšetřovatelé budou schopni monitorovat protilátkové reakce zacílené na obalové glykoproteiny SARS-CoV-2 a identifikovat subjekty vykazující imunitní odpověď s vysokými titry neutralizačních protilátek zacílených na SARS-CoV-2. To umožní izolaci monoklonálních protilátek z paměťových B lymfocytů pacientů pro terapeutické a vakcinační účely.

   Vyšetření imunity u pacientů s COVID-19 navíc umožní identifikaci závažnosti a zhoršujících se biomarkerů.

5. PROVÁDĚNÍ VÝZKUMU

Výběr se provádí na základě lékařské dokumentace každého pacienta:

• kteří měli pozitivní diagnostický výsledek COVID-19 RT-PCR
• hospitalizováni na méně než 48 hodin v CHUGA a kteří mají příznaky vyplývající z infekce.

Následuje inkluzní návštěva, při které vyšetřující lékař pacienta klinicky vyšetří.

Tento lékař zkontroluje kritéria zařazení a nezařazení, vystaví studii pacientovi a shromáždí nesouhlas pacienta a souhlas s odběrem vzorků (Příloha 2). Po něm následují biologické testy související s péčí, výzkumem a sběrem dat (viz §7.3).

Následné návštěvy (návštěvy 2 až 8 od 3. do 30. dne) probíhají tak, jak je stanoveno ve studijním kalendáři, během měsíce následujícího po zařazení. Vyšetřující lékař pacienta klinicky vyšetří, sestra následně provede odběr krve související s péčí a výzkumem (biomarkery 1., 3. a 7. den a biologický odběr 1., 3., 7., 13. den poslední hospitalizace) a asistent klinického výzkumu provádí sběr dat. Vzorky krve (sérum a periferní mononukleární krvinky ze dne 1, 13, poslední den hospitalizace) jsou vzorky nezbytné pro primární kritéria této studie.

Návštěvy následující po 7. dni (návštěvy 5 až 8) probíhají pouze v případě, že je pacient stále hospitalizován. Jinými slovy, konec hospitalizace zakládá pro skupinu A konec studie.

Pro pacienty skupiny B se může konat fakultativní návštěva. Stává se to 2 až 6 měsíců po zařazení, kdy je pacient pravidelně sledován na CHUGA a kdy je naplánována návštěva s odběrem krve, která by umožnila odběr užitečných vzorků pro výzkum.