Respuestas inmunes a COVID-19; Aislamiento de Anticuerpos Neutralizantes para Terapéutica y Vacunas. (AcNT-COVID19)

UN RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. CONOCIMIENTO ACTUAL SOBRE LA PATOLOGÍA

   Los coronavirus son una gran familia cuyos miembros comparten un tropismo por los epitelios. Suelen ser responsables de infecciones ordinarias y frecuentes en humanos, con inflamación aguda y limitada de las vías respiratorias. El hecho de que sean virus ARN (lo que les confiere una importante plasticidad), y que unos tipos infecten a animales y otros a humanos, explica que puedan ser fuente de nuevas enfermedades humanas derivadas de cepas animales. Así surgieron en los últimos años dos brotes de Coronavirus que se extendieron por varios países: el Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SRAS), en 2003; y el Síndrome Respiratorio de Oriente Medio (MERS) en 2012. En enero de 2020 se ha descrito otro brote de coronavirus: el brote de COVID-19, relacionado con el SARS-CoV-2.

   La enfermedad mencionada como enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) se detectó por primera vez en China en diciembre de 2019; un primer grupo de casos estaba fuertemente relacionado con un mercado de animales vivos, lo que sugiere un origen animal; las siguientes descripciones establecieron claramente una transmisión de persona a persona, con un número de reproducción (R0) entre 2,5 y 3,5. Algunas publicaciones científicas describieron posibles contaminaciones por parte de sujetos asintomáticos. Si bien China finalmente logró registrar una gran disminución en el número de casos diarios (82.241 casos en total con 3.309 muertes el 31 de marzo de 2020), la epidemia llegó rápidamente a muchos otros países. En Francia, varios lugares de circulación activa del virus (l'Oise, Mulhouse, la Alta Saboya) llevaron finalmente a un desarrollo importante de la epidemia en Francia (44.450 casos con 3.024 muertes el 31 de marzo de 2020).

   La enfermedad consiste en una neumonía que recuerda al Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA) en varios aspectos; tras un tiempo medio de incubación de 5 días, la sintomatología se desarrolla con tos que puede ser febril/febril, y que puede evolucionar/desarrollar hacia disnea, y en algún caso hacia SDRA tras 7 a 10 días de evolución. Si las primeras descripciones epidemiológicas señalaban una alta proporción de casos graves (más del 33%), un estudio que incluía más de 70.000 casos sugería entonces que el 15% eran graves/marcados y el 5% críticos; sin embargo, es probable que los casos asintomáticos o poco sintomáticos puedan ser numerosos, según nuevos estudios. Hasta la fecha, ningún tratamiento antiviral curativo ha demostrado eficacia clínica, pero muchos ensayos clínicos están en curso. Esta enfermedad supone un problema para el sistema sanitario por dos motivos: su contagiosidad (que exigen importantes medidas de distanciamiento social) y su morbilidad (que paralizan el sistema sanitario al requerir demasiada hospitalización en UCI).

2. RESPUESTAS INMUNE EN EL ESTADO DEL ARTE COVID-19:

   Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio es explorar las respuestas de anticuerpos en la infección por SARS-CoV-2 y, en detalle, identificar y luego producir anticuerpos monoclonales neutralizantes para uso terapéutico y de vacunas.

   En los pacientes infectados con SARS, las respuestas de anticuerpos suelen aparecer de forma temprana, en las dos semanas siguientes a los primeros síntomas y duran al menos 16 meses después del comienzo de la enfermedad. Las respuestas neutralizantes también aparecen temprano, pero tienden a disminuir rápidamente después de 16 meses. Curiosamente, se ha demostrado que los anticuerpos dirigidos contra el SARS-CoV pueden neutralizar el SARS-CoV-2, lo que sugiere la existencia de anticuerpos neutralizantes (3). Esto podría explicarse por la conservación relativamente alta entre las glicoproteínas de la envoltura de los dos virus (alrededor del 77% de homología de secuencia, una estructura muy similar y el uso del mismo receptor celular ACE2), que son los objetivos de los anticuerpos neutralizantes. Durante la infección por MERS-CoV, también se ha demostrado que las respuestas de anticuerpos aparecen en la segunda semana de infección y duran al menos 18 meses. Se ha descrito una respuesta neutralizante anti-MERS-CoV: la carga viral de los pacientes es inversamente proporcional a los niveles de Ab neutralizantes. Esos anticuerpos neutralizantes por sí solos no son suficientes para eliminar la infección (4). Curiosamente, la respuesta de anticuerpos protectores contra otros coronavirus como OC43 y 229E parece mucho más limitada en el tiempo (5).

   Una caracterización de la respuesta de anticuerpos durante el COVID-19, especialmente la actividad neutralizante, es importante para el progreso que permitirá:

   • Comprender la naturaleza y duración de la respuesta humoral potencialmente protectora durante y después de la infección por SARS-CoV-2
   • Estudiar la evolución de las respuestas de anticuerpos IgM e IgG frente a las glicoproteínas de superficie del SARS-CoV-2, especialmente la proteína espiga (SARS2-S)
   • Estudiar la evolución de las respuestas de anticuerpos neutralizantes. De hecho, es esencial comprender mejor en qué medida se genera una fuerte inmunidad humoral en todos los pacientes infectados, si esta respuesta varía de acuerdo con la gravedad y duración de la infección.
   • Para examinar los sueros de los pacientes en busca de individuos que muestren títulos altos de neutralización y quizás anticuerpos neutralizantes contra diferentes coronavirus. Es fundamental entender si algunos pacientes pueden producir anticuerpos neutralizantes, capaces de neutralizar diferentes coronavirus.
   • Estudiar la existencia de una potencial infección viral facilitada por anticuerpos. De hecho, el aumento de la infectividad mediada por anticuerpos se ha descrito para otros coronavirus y podría dificultar el desarrollo de la vacuna (6).

   Tras esta caracterización, los investigadores podrán aislar anticuerpos monoclonales humanos de pacientes seleccionados. El aislamiento de anticuerpos podría permitir, en particular, enfoques terapéuticos y vacunales en el futuro, para tratar y prevenir no solo el COVID-19, sino también otras infecciones por coronavirus ya existentes o en caso de un nuevo brote de coronavirus.

   Así, los anticuerpos monoclonales más prometedores (alta afinidad, alta capacidad neutralizante) serán seleccionados y optimizados para un futuro desarrollo como agente terapéutico (compuestos líderes).

   En fin, los investigadores podrán utilizar anticuerpos monoclonales aislados como herramientas en enfoques estructurales para la determinación de epítopos de neutralización y el desarrollo de enfoques vacunales (vacunología inversa).

   Para aislar anticuerpos monoclonales humanos en individuos seleccionados por su respuesta humoral de interés, las células B de memoria positivas para IgG específicas que portan anticuerpos contra los objetivos seleccionados en su superficie se clasifican mediante citometría de flujo. Como parte de este proyecto, se clasificarán las células B que producen anticuerpos que reconocen las proteínas recombinantes biotiniladas del SARS-2-S conjugadas con estreptavidina marcada con fluorocromo. Estas proteínas se producen por transfección de células 293F y luego se purifican. Una estrategia alternativa consiste en activar las células B y examinar los sobrenadantes para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes específicos en ensayos de microneutralización que implican, por ejemplo, el uso de virus pseudotipados con SARS-2-S. Después de identificar las células B específicas, los genes de inmunoglobulina de interés serán amplificados por PCR a partir de células clonales para identificar las cadenas pesada y ligera (lambda o kappa), de acuerdo con los métodos utilizados anteriormente para el aislamiento de anticuerpos contra el VIH (7- 10).

   Las cadenas pesada y ligera amplificadas se clonan posteriormente en el vector de expresión mediante recombinación homóloga. Los anticuerpos correspondientes se producen por transfección de células 293F con la combinación adecuada de cadenas pesadas y ligeras. Después de las pruebas de purificación y reactividad frente a la proteína SARS-2-S, evaluaremos la función de neutralización para identificar y priorizar los candidatos para una caracterización más profunda con el fin de identificar los compuestos principales.

3. BIOMARCADORES:

   Además, los investigadores tienen como objetivo explorar los otros jugadores de la inmunidad, las células inmunes, el complemento y las citocinas, con el fin de identificar biomarcadores predictivos de mal pronóstico. Estos análisis de laboratorio podrían ser capaces de predecir un mal pronóstico y podrían contribuir a adaptar la atención médica.

   Las investigaciones incluirán:

   • Subpoblación de linfocitos T, B y NK y subpoblación de monocitos HLA-DR estudiada por citometría de flujo.
   • el estudio del sistema del complemento (C3, C4, CH50 y CH50a).
   • el estudio de las citocinas y en particular la medición de IL-6 e IL-10 en los días 1, 3 y 7 de hospitalización del paciente.

4. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN Y RESULTADOS ESPERADOS Los investigadores podrán monitorear las respuestas de anticuerpos dirigidas a las glicoproteínas de la envoltura del SARS-CoV-2 e identificar sujetos que muestren una respuesta inmunitaria con títulos altos de anticuerpos neutralizantes dirigidos al SARS-CoV-2. Esto permitirá el aislamiento de anticuerpos monoclonales de los linfocitos B de memoria de los pacientes con fines terapéuticos y vacunales.

   Además, la investigación de inmunidad en pacientes con COVID-19 permitirá identificar biomarcadores de gravedad y empeoramiento.

5. CONDUCTA DE INVESTIGACIÓN

La selección se realiza en base a la historia clínica de cada paciente:

• que tuvo un resultado diagnóstico positivo de COVID-19 RT-PCR
• hospitalizados menos de 48h en el CHUGA y que presenten síntomas derivados de la infección.

Le sigue una visita de inclusión durante la cual un médico investigador examina clínicamente al paciente.

Este médico comprueba los criterios de inclusión y no inclusión, expone el ensayo al paciente y recoge el consentimiento de no oposición y muestreo del paciente (Anexo 2). Le siguen las pruebas biológicas relacionadas con el cuidado, la investigación y la recopilación de datos (ver §7.3)

Las visitas de seguimiento (visitas 2 a 8 del día 3 al día 30) suceden según lo establecido en el calendario del estudio durante el mes siguiente a la inclusión. Un médico investigador examina clínicamente al paciente, luego una enfermera toma muestras de sangre relacionadas con la atención y la investigación (biomarcadores en los días 1, 3 y 7 y recolección biológica en los días 1, 3, 7, 13, último día de hospitalización) y un asistente de investigación clínica hace la recopilación de datos. La muestra de sangre (suero y células de sangre mononuclear periférica del día 1, 13, último día de hospitalización) son las muestras necesarias para los criterios primarios de este estudio.

Las visitas posteriores al día 7 (visitas 5 a 8) solo ocurren si el paciente sigue hospitalizado. Es decir, el final de la estancia hospitalaria establece el final del estudio para el grupo A.

Se puede realizar una visita opcional para los pacientes del grupo b. Ocurre de 2 a 6 meses después de la inclusión cuando el paciente es seguido regularmente en el CHUGA y cuando se programa una visita con extracción de sangre que permitiría la recolección de muestras útiles para la investigación.