Immunantworten auf COVID-19; Isolierung von neutralisierenden Antikörpern für Therapeutika und Impfstoffe. (AcNT-COVID19)

A RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. AKTUELLES WISSEN ÜBER DIE PATHOLOGIE

   Coronaviren sind eine große Familie, deren Mitglieder einen Tropismus für Epithelien teilen. Sie sind in der Regel für gewöhnliche und häufige Infektionen beim Menschen mit akuten und begrenzten Entzündungen der Atemwege verantwortlich. Die Tatsache, dass es sich um RNA-Viren handelt (was ihnen eine wichtige Plastizität verleiht) und dass einige Arten Tiere und andere Menschen infizieren, erklärt, dass sie eine Quelle neuer menschlicher Krankheiten sein können, die von Tierstämmen ausgehen. So kam es in den vergangenen Jahren zu zwei Coronavirus-Ausbrüchen, die sich in mehreren Ländern ausbreiteten: Das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS) im Jahr 2003; und das Middle East Respiratory Syndrome (MERS) im Jahr 2012. Im Januar 2020 wurde ein weiterer Coronavirus-Ausbruch beschrieben: der COVID-19-Ausbruch im Zusammenhang mit SARS-CoV-2.

   Die als Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) bezeichnete Krankheit wurde erstmals im Dezember 2019 in China nachgewiesen; ein erstes Fallcluster war stark mit einem Markt für lebende Tiere verbunden, was auf einen tierischen Ursprung hindeutet; Die folgenden Beschreibungen haben eindeutig eine Mensch-zu-Mensch-Übertragung mit einer Reproduktionszahl (R0) zwischen 2,5 und 3,5 festgestellt. Einige wissenschaftliche Veröffentlichungen beschrieben mögliche Kontaminationen durch asymptomatische Probanden. Während es China schließlich gelang, einen starken Rückgang der täglichen Fälle zu verzeichnen (insgesamt 82.241 Fälle mit 3.309 Todesfällen am 31. März 2020), erreichte die Epidemie schnell viele andere Länder. In Frankreich führten mehrere Orte aktiver Viruszirkulation (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) schließlich zu einer wichtigen Entwicklung der Epidemie in Frankreich (44.450 Fälle mit 3.024 Todesfällen am 31. März 2020).

   Die Krankheit besteht aus einer Lungenentzündung, die in mehreren Aspekten an das akute Atemnotsyndrom (ARDS) erinnert; Nach einer mittleren Inkubationszeit von 5 Tagen entwickeln sich Symptome mit Husten, der fiebrig/fieberhaft sein kann und sich nach 7 bis 10 Tagen Entwicklung zu Dyspnoe und in einigen Fällen zu ARDS entwickeln/entwickeln kann. Wenn die ersten epidemiologischen Beschreibungen einen hohen Anteil an schweren Fällen (mehr als 33 %) angaben, deutete eine Studie mit mehr als 70.000 Fällen darauf hin, dass 15 % der Fälle schwerwiegend/ausgeprägt und 5 % kritisch waren; neuen Studien zufolge ist es jedoch wahrscheinlich, dass asymptomatische oder wenig symptomatische Fälle zahlreich sein können. Bisher hat keine kurative antivirale Behandlung eine klinische Wirksamkeit gezeigt, aber viele klinische Studien sind im Gange. Diese Krankheit ist aus zwei Gründen ein Problem für das Gesundheitssystem: ihre Ansteckungsgefahr (die große soziale Distanzierungsmaßnahmen erfordert) und ihre Morbidität (die das Gesundheitssystem durch zu viele Krankenhausaufenthalte auf der Intensivstation lähmen).

2. IMMUNREAKTIONEN IM STAND DER TECHNIK VON COVID-19:

   Das Hauptziel dieser Studie besteht daher darin, die Antikörperreaktionen bei einer SARS-CoV-2-Infektion zu untersuchen und anschließend neutralisierende monoklonale Antikörper für therapeutische und Impfstoffanwendungen zu identifizieren und herzustellen.

   Bei SARS-infizierten Patienten treten Antikörperreaktionen normalerweise früh auf, in den zwei Wochen nach den ersten Symptomen, und halten mindestens 16 Monate nach Beginn der Krankheit an. Neutralisierende Reaktionen treten ebenfalls früh auf, lassen aber nach 16 Monaten schnell nach. Interessanterweise wurde gezeigt, dass Antikörper, die auf SARS-CoV abzielen, in der Lage sind, SARS-CoV-2 zu neutralisieren, was auf die Existenz neutralisierender Antikörper hindeutet (3). Dies könnte durch die relativ hohe Konservierung zwischen den beiden Virenhüllen-Glykoproteinen (ca. 77 % Sequenzhomologie, eine sehr ähnliche Struktur und die Verwendung des gleichen zellulären Rezeptors ACE2) erklärt werden, die die Ziele neutralisierender Antikörper sind. Während einer MERS-CoV-Infektion wurde außerdem gezeigt, dass Antikörperreaktionen in der zweiten Infektionswoche auftreten und mindestens 18 Monate anhalten. Eine neutralisierende Reaktion auf Anti-MERS-CoV wurde beschrieben: Die Viruslast der Patienten ist umgekehrt proportional zu den neutralisierenden Ab-Spiegeln. Diese neutralisierenden Antikörper allein reichen nicht aus, um eine Infektion zu beseitigen (4). Interessanterweise scheint die schützende Antikörperantwort gegen andere Coronaviren wie OC43 und 229E viel zeitlich begrenzter zu sein (5).

   Eine Charakterisierung der Antikörperantwort während COVID-19, insbesondere der neutralisierenden Aktivität, ist wichtig für den Fortschritt, den sie ermöglichen wird:

   • Verständnis der Art und Dauer der potenziell schützenden humoralen Reaktion während und nach der Infektion durch SARS-CoV-2
   • Untersuchung der Entwicklung von IgM- und IgG-Antikörperantworten gegen SARS-CoV-2-Oberflächenglykoproteine, insbesondere das Spike-Protein (SARS2-S)
   • Um die Evolution der neutralisierenden Antikörperreaktionen zu untersuchen. Tatsächlich ist es wichtig, besser zu verstehen, in welchem ​​Ausmaß eine starke humorale Immunität bei allen infizierten Patienten erzeugt wird, wenn diese Reaktion entsprechend der Schwere und Dauer der Infektion variiert.
   • Screening von Patientenseren auf der Suche nach Personen mit hohen Neutralisationstitern und möglicherweise nach neutralisierenden Antikörpern gegen verschiedene Coronaviren. Es ist wichtig zu verstehen, ob einige Patienten neutralisierende Antikörper produzieren können, die in der Lage sind, verschiedene Coronaviren zu neutralisieren.
   • Untersuchung der Existenz einer potenziellen Virusinfektionserleichterung durch Antikörper. Tatsächlich wurde die durch Antikörper vermittelte Erhöhung der Infektiosität für andere Coronaviren beschrieben und könnte die Impfstoffentwicklung herausfordernder machen (6).

   Nach dieser Charakterisierung werden die Forscher in der Lage sein, menschliche monoklonale Antikörper von ausgewählten Patienten zu isolieren. Die Antikörperisolierung könnte insbesondere zukünftige Therapie- und Impfansätze ermöglichen, um nicht nur das COVID-19, sondern auch andere bereits bestehende Coronavirus-Infektionen oder im Falle eines neuen Coronavirus-Ausbruchs zu behandeln und zu verhindern.

   Daher werden die vielversprechendsten monoklonalen Antikörper (hohe Affinität, hohe Neutralisierungskapazität) ausgewählt und für eine zukünftige Entwicklung als Therapeutikum (Leitsubstanzen) optimiert.

   Kurzum, die Forscher werden in der Lage sein, isolierte monoklonale Antikörper als Werkzeuge in strukturellen Ansätzen für die Bestimmung von Neutralisierungsepitopen und die Entwicklung von Impfstoffansätzen (umgekehrte Vakzinologie) zu verwenden.

   Um menschliche monoklonale Antikörper in Personen zu isolieren, die aufgrund ihrer interessierenden humoralen Reaktion ausgewählt wurden, werden die spezifischen IgG-positiven Gedächtnis-B-Zellen, die Antikörper gegen die ausgewählten Ziele an ihrer Oberfläche tragen, durch Durchflusszytometrie sortiert. Im Rahmen dieses Projekts werden B-Zellen, die Antikörper produzieren, die biotinylierte rekombinante SARS-2-S-Proteine ​​erkennen, die an Fluorochrom-markiertes Streptavidin konjugiert sind, sortiert. Diese Proteine ​​werden durch Transfektion von 293F-Zellen hergestellt und anschließend gereinigt. Eine alternative Strategie besteht darin, B-Zellen zu aktivieren und Überstände auf das Vorhandensein spezifischer neutralisierender Antikörper in Mikroneutralisationsassays zu screenen, die beispielsweise die Verwendung von mit SARS-2-S pseudotypisierten Viren umfassen. Nach der Identifizierung der spezifischen B-Zellen werden die interessierenden Immunglobulin-Gene durch PCR aus klonalen Zellen amplifiziert, um die schweren und leichten (Lambda- oder Kappa-) Ketten zu identifizieren, entsprechend den Methoden, die zuvor für die Isolierung von Antikörpern gegen HIV verwendet wurden (7- 10).

   Amplifizierte schwere und leichte Ketten werden anschließend durch homologe Rekombination in den Expressionsvektor kloniert. Die entsprechenden Antikörper werden durch 293F-Zelltransfektion mit der entsprechenden Kombination aus schweren und leichten Ketten hergestellt. Nach der Reinigung und den Reaktivitätstests gegen das SARS-2-S-Protein werden wir die neutralisierende Funktion bewerten, um die Kandidaten für eine tiefere Charakterisierung zu identifizieren und zu priorisieren, um Leitverbindungen zu identifizieren.

3. BIOMARKER:

   Darüber hinaus wollen die Forscher die anderen Akteure der Immunität, Immunzellen, Komplement und Zytokine, untersuchen, um prädiktive Biomarker für eine schlechte Prognose zu identifizieren. Diese Laboranalysen könnten in der Lage sein, eine schlechte Prognose vorherzusagen und dazu beitragen, die medizinische Versorgung anzupassen.

   Die Untersuchungen umfassen:

   • T-, B- und NK-Lymphozyten-Subpopulation und Monozyten-HLA-DR-Subpopulation untersucht durch Durchflusszytometrie.
   • die Untersuchung des Komplementsystems (C3, C4, CH50 & CH50a).
   • die Untersuchung von Zytokinen und insbesondere die Messung von IL-6 und IL-10 an den Tagen 1, 3 und 7 des Krankenhausaufenthalts des Patienten.

4. FORSCHUNGSHYPOTHESE UND ERWARTETE ERGEBNISSE Die Forscher werden in der Lage sein, Antikörperreaktionen zu überwachen, die auf die Hüllglykoproteine ​​von SARS-CoV-2 abzielen, und Probanden identifizieren, die eine Immunantwort mit hohen Titern von neutralisierenden Antikörpern zeigen, die auf SARS-CoV-2 abzielen. Dies wird die Isolierung von monoklonalen Antikörpern aus Gedächtnis-B-Lymphozyten von Patienten für therapeutische und Impfstoffzwecke ermöglichen.

   Darüber hinaus wird die Immunitätsuntersuchung bei COVID-19-Patienten die Identifizierung von Schweregraden und sich verschlechternden Biomarkern ermöglichen.

5. FORSCHUNGSVERHALTEN

Die Auswahl erfolgt auf der Grundlage der Krankenakte für jeden Patienten:

• die ein positives diagnostisches Ergebnis der COVID-19 RT-PCR hatten
• für weniger als 48 Stunden im CHUGA hospitalisiert sind und Symptome aufgrund der Infektion aufweisen.

Es folgt eine Aufnahmevisite, bei der ein untersuchender Arzt den Patienten klinisch untersucht.

Dieser Arzt überprüft die Einschluss- und Nichteinschlusskriterien, legt die Studie dem Patienten vor und holt den Nichteinspruch und die Einwilligung des Patienten ein (Anhang 2). Es folgen die biologischen Tests in Bezug auf Pflege, Forschung und Datenerhebung (siehe §7.3).

Die Nachsorgeuntersuchungen (Besuche 2 bis 8 von Tag 3 bis Tag 30) finden wie im Studienkalender festgelegt über den Monat nach der Aufnahme statt. Ein untersuchender Arzt untersucht den Patienten klinisch, eine Krankenschwester führt dann Blutentnahmen im Zusammenhang mit Pflege und Forschung durch (Biomarker an Tag 1, 3 und 7 und biologische Entnahme an Tag 1, 3, 7, 13, letzter Krankenhaustag) und ein klinischer Forschungsassistent führt die Datenerhebung durch. Die Blutprobe (Serum und periphere mononukleäre Blutzellen von Tag 1, 13, Tag des letzten Krankenhausaufenthalts) sind die Proben, die für die primären Kriterien dieser Studie erforderlich sind.

Die Besuche nach Tag 7 (Besuche 5 bis 8) finden nur statt, wenn der Patient noch im Krankenhaus ist. Mit anderen Worten, das Ende des Krankenhausaufenthalts legt das Ende der Studie für Gruppe A fest.

Für Patienten der Gruppe b kann ein optionaler Besuch stattfinden. Dies geschieht 2 bis 6 Monate nach der Aufnahme, wenn der Patient regelmäßig im CHUGA nachuntersucht wird und wenn ein Besuch mit Blutentnahme geplant ist, der die Entnahme nützlicher Proben für die Forschung ermöglichen würde.