Immuunreacties op COVID-19; Isolatie van neutraliserende antilichamen voor therapieën en vaccins. (AcNT-COVID19)

EEN RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. HUIDIGE KENNIS OVER DE PATHOLOGIE

   Coronavirussen vormen een grote familie waarvan de leden een tropisme voor epitheel delen. Ze zijn meestal verantwoordelijk voor gewone en frequente infecties bij mensen, met acute en beperkte ontsteking van de luchtwegen. Het feit dat het RNA-virussen zijn (waardoor ze een belangrijke plasticiteit hebben), en dat sommige soorten dieren infecteren en andere mensen infecteren, verklaart dat ze een bron kunnen zijn van nieuwe ziekten bij de mens die voortkomen uit dierlijke stammen. Zo ontstonden in de afgelopen jaren twee uitbraken van het coronavirus die zich in verschillende landen verspreidden: het Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), in 2003; en het Middle East Respiratory Syndrome (MERS) in 2012. In januari 2020 is er weer een uitbraak van het coronavirus beschreven: de uitbraak van COVID-19, gerelateerd aan SARS-CoV-2.

   De ziekte die wordt genoemd als coronavirusziekte 2019 (COVID-19) is in december 2019 voor het eerst in China ontdekt; een eerste casuscluster hield sterk verband met een markt voor levende dieren, wat wijst op een dierlijke oorsprong; de volgende beschrijvingen hebben duidelijk een overdracht van mens op mens vastgesteld, met een reproductiegetal (R0) tussen 2,5 en 3,5. Sommige wetenschappelijke publicaties beschreven mogelijke besmettingen door asymptomatische proefpersonen. Terwijl China er uiteindelijk in slaagde een grote daling van het aantal dagelijkse gevallen vast te stellen (82.241 gevallen in totaal met 3.309 doden op 31 maart 2020), bereikte de epidemie snel veel andere landen. In Frankrijk hebben verschillende sites met actieve viruscirculatie (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) uiteindelijk geleid tot een belangrijke ontwikkeling van de epidemie in Frankrijk (44.450 gevallen met 3.024 doden op 31 maart 2020).

   De ziekte bestaat uit een longontsteking die in verschillende opzichten doet denken aan het Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS); na een mediane incubatietijd van 5 dagen ontwikkelen zich symptomen met hoest die febrieel/koortsig kan zijn en die kan evolueren/zich ontwikkelen tot kortademigheid, en in sommige gevallen tot ARDS na 7 tot 10 dagen evolutie. Als de eerste epidemiologische beschrijvingen een groot aantal ernstige gevallen vermeldden (meer dan 33%), suggereerde een onderzoek met meer dan 70.000 gevallen dat 15% gevallen ernstig/duidelijk waren en 5% kritiek; het is echter waarschijnlijk dat asymptomatische of weinig symptomatische gevallen talrijk kunnen zijn, volgens nieuwe studies. Tot op heden heeft geen enkele genezende antivirale behandeling klinische werkzaamheid aangetoond, maar er zijn veel klinische onderzoeken gaande. Deze ziekte vormt om twee redenen een probleem voor de gezondheidszorg: de besmettelijkheid ervan (waarvoor grote sociale afstandsmaatregelen nodig zijn) en de morbiditeit (die de gezondheidszorg verlamt doordat er te veel IC-opnames nodig zijn).

2. IMMUUNRESPONS IN COVID-19 STAND VAN DE TECHNIEK:

   Het hoofddoel van deze studie is daarom het onderzoeken van de antilichaamresponsen bij SARS-CoV-2-infectie en het nauwkeurig identificeren en vervolgens produceren van neutraliserende monoklonale antilichamen voor therapeutisch en vaccingebruik.

   Bij met SARS geïnfecteerde patiënten treden de antilichaamreacties meestal vroeg op, in de twee weken na de eerste symptomen, en duren ze minstens 16 maanden na het begin van de ziekte. Neutraliserende reacties verschijnen ook vroeg, maar nemen na 16 maanden snel af. Interessant is dat is aangetoond dat antilichamen gericht tegen SARS-CoV SARS-CoV-2 kunnen neutraliseren, wat suggereert dat er neutraliserende antilichamen bestaan ​​(3). Dit zou kunnen worden verklaard door de relatief hoge conservering tussen de twee virussen die glycoproteïnen omhullen (ongeveer 77% van de sequentiehomologie, een zeer vergelijkbare structuur en het gebruik van dezelfde cellulaire receptor ACE2), die het doelwit zijn van neutraliserende antilichamen. Tijdens MERS-CoV-infectie is ook aangetoond dat antilichaamresponsen optreden in de tweede week van infectie en ten minste 18 maanden aanhouden. Er is een neutraliserende respons anti-MERS-CoV beschreven: de virale belasting van patiënten is omgekeerd evenredig met de neutraliserende Ab-spiegels. Die neutraliserende antilichamen alleen zijn niet voldoende voor het opruimen van infecties (4). Interessant genoeg lijkt de beschermende antilichaamrespons tegen andere coronavirussen zoals OC43 en 229E veel beperkter in de tijd (5).

   Een karakterisering van de antilichaamrespons tijdens COVID-19, met name de neutraliserende activiteit, is belangrijk voor de voortgang die het mogelijk maakt:

   • De aard en duur begrijpen van de potentieel beschermende humorale respons tijdens en na de infectie door SARS-CoV-2
   • Om de evolutie van IgM- en IgG-antilichaamresponsen tegen SARS-CoV-2-oppervlakteglycoproteïnen te bestuderen, met name het spike-eiwit (SARS2-S)
   • De evolutie van neutraliserende antilichaamresponsen bestuderen. Het is inderdaad essentieel om beter te begrijpen in welke mate een sterke humorale immuniteit wordt gegenereerd bij alle geïnfecteerde patiënten, als deze respons varieert in overeenstemming met de ernst en de duur van de infectie.
   • Om de sera van patiënten te screenen op zoek naar personen met hoge neutralisatietiters en misschien naar neutraliserende antilichamen tegen verschillende coronavirussen. Het is essentieel om te begrijpen of sommige patiënten neutraliserende antilichamen kunnen produceren die verschillende coronavirussen kunnen neutraliseren.
   • Om het bestaan ​​van een mogelijke virale infectie te bestuderen die wordt vergemakkelijkt door antilichamen. De toename van besmettelijkheid gemedieerd door antilichamen is inderdaad beschreven voor andere coronavirussen en zou de ontwikkeling van vaccins uitdagender kunnen maken (6).

   Na deze karakterisering zullen de onderzoekers menselijke monoklonale antilichamen van geselecteerde patiënten kunnen isoleren. Isolatie van antilichamen zou in de toekomst met name therapeutische en vaccinbenaderingen mogelijk kunnen maken, om niet alleen COVID-19 te behandelen en te voorkomen, maar ook andere reeds bestaande coronavirusinfecties of in het geval van een nieuwe uitbraak van het coronavirus.

   Zo zullen de meest veelbelovende monoklonale antilichamen (hoge affiniteit, hoog neutraliserend vermogen) worden geselecteerd en geoptimaliseerd voor een toekomstige ontwikkeling als therapeutisch middel (leadverbindingen).

   Uiteindelijk zullen de onderzoekers geïsoleerde monoklonale antilichamen kunnen gebruiken als hulpmiddelen bij structurele benaderingen voor de bepaling van neutralisatie-epitopen en de ontwikkeling van vaccinbenaderingen (reverse vaccinologie).

   Om menselijke monoklonale antilichamen te isoleren in individuen die zijn geselecteerd vanwege hun humorale respons van belang, worden de specifieke IgG-positieve B-geheugencellen die antilichamen tegen de geselecteerde doelen aan hun oppervlak dragen, gesorteerd door middel van flowcytometrie. Als onderdeel van dit project zullen B-cellen die antilichamen produceren die SARS-2-S gebiotinyleerde recombinante eiwitten geconjugeerd aan fluorochroom-gelabeld streptavidine herkennen, worden gesorteerd. Deze eiwitten worden geproduceerd door transfectie van 293F-cellen en worden vervolgens gezuiverd. Een alternatieve strategie bestaat uit het activeren van B-cellen en het screenen van supernatanten op de aanwezigheid van specifieke neutraliserende antilichamen in microneutralisatie-assays waarbij bijvoorbeeld virussen worden gebruikt die zijn gepseudotypeerd met SARS-2-S. Na identificatie van de specifieke B-cellen, zullen de immunoglobulinegenen van belang worden geamplificeerd door PCR van klonale cellen om de zware en lichte (lambda of kappa) ketens te identificeren, in overeenstemming met methoden die eerder werden gebruikt voor de isolatie van antilichamen tegen HIV (7- 10).

   Geamplificeerde zware en lichte ketens worden vervolgens gekloneerd in expressievector door middel van homologe recombinatie. De overeenkomstige antilichamen worden geproduceerd door 293F-celtransfectie met de juiste combinatie van zware en lichte ketens. Na zuivering en reactiviteitstests tegen SARS-2-S-eiwit, evalueren we de neutraliserende functie om de kandidaten te identificeren en te prioriteren voor een diepere karakterisering om lead-verbindingen te identificeren.

3. BIOMARKERS:

   Daarnaast willen de onderzoekers de andere immuniteitsspelers, immuuncellen, complement en cytokines onderzoeken, met als doel voorspellende biomarkers van een slechte prognose te identificeren. Deze laboratoriumanalyses zouden een slechte prognose kunnen voorspellen en kunnen bijdragen aan het aanpassen van de medische zorg.

   De onderzoeken omvatten:

   • T-, B- en NK-lymfocytensubpopulatie en monocyten HLA-DR-subpopulatie bestudeerd met flowcytometrie.
   • de studie van het complementsysteem (C3, C4, CH50 & CH50a).
   • de studie van cytokines en met name de meting van IL-6 en IL-10 op dag 1, 3 en 7 van ziekenhuisopname van de patiënt.

4. ONDERZOEKSHYPOTHESE EN VERWACHTE RESULTATEN De onderzoekers zullen antilichaamresponsen kunnen volgen die gericht zijn op de omhullende glycoproteïnen van SARS-CoV-2 en proefpersonen kunnen identificeren die een immuunrespons vertonen met hoge titers van neutraliserende antilichamen gericht op SARS-CoV-2. Dit zal de isolatie van monoklonale antilichamen uit de geheugen-B-lymfocyten van patiënten mogelijk maken voor therapeutische en vaccindoeleinden.

   Bovendien zal het immuniteitsonderzoek bij COVID-19-patiënten de identificatie van de ernst en verslechterende biomarkers mogelijk maken.

5. ONDERZOEKSGEDRAG

De selectie gebeurt op basis van het medisch dossier van elke patiënt:

• die een positief diagnostisch resultaat hadden van COVID-19 RT-PCR
• minder dan 48 uur in het CHUGA zijn opgenomen en symptomen hebben die het gevolg zijn van de infectie.

Daarna volgt een opnamebezoek waarbij een onderzoekend arts de patiënt klinisch onderzoekt.

Deze arts controleert de inclusie- en niet-inclusiecriteria, stelt de proef voor aan de patiënt en verzamelt de toestemming van de patiënt voor niet-oppositie en monsterafname (bijlage 2). Daarna volgen de biologische testen die te maken hebben met zorg, onderzoek en dataverzameling (zie §7.3)

De vervolgbezoeken (bezoeken 2 tot 8 van dag 3 tot dag 30) vinden plaats zoals vastgelegd in de studiekalender gedurende de maand na opname. Een onderzoekend arts onderzoekt de patiënt klinisch, een verpleegkundige doet vervolgens bloedafname gerelateerd aan zorg en onderzoek (biomarkers op dag 1, 3 en 7 en biologische afname op dag 1, 3, 7, 13, laatste opnamedag) en een klinisch onderzoeksassistent doet gegevensverzameling. Het bloedmonster (serum en perifere mononucleaire bloedcellen van dag 1, 13, laatste ziekenhuisopnamedag) zijn de monsters die nodig zijn voor de primaire criteria van deze studie.

De bezoeken na dag 7 (bezoeken 5 tot 8) vinden alleen plaats als de patiënt nog in het ziekenhuis ligt. Met andere woorden, het einde van het verblijf in het ziekenhuis betekent het einde van de studie voor groep A.

Voor patiënten uit groep b kan een facultatief bezoek plaatsvinden. Het gebeurt 2 tot 6 maanden na opname wanneer de patiënt regelmatig wordt opgevolgd in het CHUGA en wanneer een bezoek met bloedafname is gepland om bruikbare stalen voor het onderzoek te verzamelen.