Respostas Imunitárias à COVID-19; Isolamento de Anticorpos Neutralizantes para Terapêutica e Vacina. (AcNT-COVID19)

A RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. CONHECIMENTO ATUAL SOBRE A PATOLOGIA

   Os coronavírus são uma grande família cujos membros compartilham um tropismo por epitélios. Geralmente são responsáveis ​​por infecções comuns e frequentes em humanos, com inflamação aguda e limitada do trato respiratório. O facto de serem vírus de ARN (o que lhes confere uma plasticidade importante), e de alguns tipos infectarem animais e outros infectarem humanos, explicam que podem ser uma fonte de novas doenças humanas decorrentes de estirpes animais. Assim surgiram dois surtos de Coronavírus que se espalharam por vários países nos últimos anos: a Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS), em 2003; e a Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS) em 2012. Em janeiro de 2020, outro surto de coronavírus foi descrito: o surto de COVID-19, relacionado ao SARS-CoV-2.

   A doença mencionada como doença de coronavírus 2019 (COVID-19) foi detectada pela primeira vez na China em dezembro de 2019; um primeiro grupo de casos foi fortemente relacionado a um mercado de animais vivos, sugerindo uma origem animal; as descrições a seguir estabeleceram claramente uma transmissão de humano para humano, com um número de reprodução (R0) entre 2,5 e 3,5. Algumas publicações científicas descreveram potenciais contaminações por indivíduos assintomáticos. Enquanto a China finalmente conseguiu registrar uma grande queda no número de casos diários (82.241 casos totais com 3.309 mortes em 31 de março de 2020), a epidemia atingiu rapidamente muitos outros países. Na França, vários locais de circulação ativa do vírus (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) finalmente levaram a um importante desenvolvimento da epidemia na França (44.450 casos com 3.024 mortes em 31 de março de 2020).

   A doença consiste em uma pneumonia lembrando a Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) em vários aspectos; após um tempo médio de incubação de 5 dias, desenvolve sintomas com tosse que pode ser febril/febril, e que pode evoluir/evoluir para dispneia, e em alguns casos para SDRA após 7 a 10 dias de evolução. Se as primeiras descrições epidemiológicas indicavam uma alta proporção de casos graves (mais de 33%), um estudo incluindo mais de 70.000 casos sugeria que 15% dos casos eram graves/acentuados e 5% críticos; no entanto, é provável que casos assintomáticos ou pouco sintomáticos possam ser numerosos, de acordo com novos estudos. Até o momento, nenhum tratamento antiviral curativo demonstrou eficácia clínica, mas muitos ensaios clínicos estão em andamento. Essa doença é um problema para o sistema de saúde por dois motivos: sua contagiosidade (que exige grandes medidas de distanciamento social) e sua morbidade (que paralisa o sistema de saúde por exigir internações excessivas em UTI).

2. RESPOSTAS IMUNE NO ESTADO DA ARTE DO COVID-19:

   O principal objetivo deste estudo é, portanto, explorar as respostas de anticorpos na infecção por SARS-CoV-2 e, em seguida, identificar e produzir anticorpos monoclonais neutralizantes para uso terapêutico e vacinal.

   Em pacientes infectados com SARS, as respostas de anticorpos geralmente aparecem precocemente, nas duas semanas seguintes aos primeiros sintomas e duram pelo menos 16 meses após o início da doença. As respostas neutralizantes também aparecem cedo, mas tendem a diminuir rapidamente após 16 meses. Curiosamente, foi demonstrado que os anticorpos direcionados ao SARS-CoV são capazes de neutralizar o SARS-CoV-2, sugerindo a existência de anticorpos neutralizantes (3). Isso pode ser explicado pela conservação relativamente alta entre as glicoproteínas do envelope dos dois vírus (cerca de 77% de homologia de sequência, estrutura muito semelhante e uso do mesmo receptor celular ACE2), que são os alvos dos anticorpos neutralizantes. Durante a infecção por MERS-CoV, também foi demonstrado que as respostas de anticorpos aparecem na segunda semana de infecção e duram pelo menos 18 meses. Uma resposta neutralizante anti-MERS-CoV foi descrita: a carga viral dos pacientes sendo inversamente proporcional aos níveis de Ab neutralizantes. Esses anticorpos neutralizantes sozinhos não são suficientes para eliminar a infecção (4). Curiosamente, a resposta protetora de anticorpos contra outros coronavírus como OC43 e 229E parece muito mais limitada no tempo (5).

   Uma caracterização da resposta de anticorpos durante o COVID-19, especialmente a atividade neutralizante, é importante para o progresso que permitirá:

   • Compreender a natureza e a duração da resposta humoral potencialmente protetora durante e após a infecção por SARS-CoV-2
   • Estudar a evolução das respostas dos anticorpos IgM e IgG contra as glicoproteínas de superfície SARS-CoV-2, especialmente a proteína spike (SARS2-S)
   • Estudar a evolução das respostas de anticorpos neutralizantes. De facto, é fundamental compreender melhor em que medida é gerada uma forte imunidade humoral em todos os doentes infetados, se esta resposta varia consoante a gravidade e a duração da infeção.
   • Para rastrear soros de pacientes em busca de indivíduos que apresentem altos títulos de neutralização e talvez anticorpos neutralizantes contra diferentes coronavírus. É fundamental entender se alguns pacientes podem produzir anticorpos neutralizantes, capazes de neutralizar diferentes coronavírus.
   • Estudar a existência de uma potencial facilitação de infecção viral por anticorpos. De fato, o aumento da infecciosidade mediada por anticorpos foi descrito para outros coronavírus e pode tornar o desenvolvimento da vacina mais desafiador (6).

   Após essa caracterização, os investigadores poderão isolar anticorpos monoclonais humanos de pacientes selecionados. O isolamento de anticorpos pode permitir abordagens terapêuticas e vacinais no futuro, para tratar e prevenir não apenas o COVID-19, mas também outras infecções por coronavírus já existentes ou no caso de um novo surto de coronavírus.

   Assim, os anticorpos monoclonais mais promissores (alta afinidade, alta capacidade neutralizante) serão selecionados e otimizados para um futuro desenvolvimento como agente terapêutico (compostos líderes).

   Em suma, os investigadores poderão usar anticorpos monoclonais isolados como ferramentas em abordagens estruturais para a determinação de epítopos de neutralização e no desenvolvimento de abordagens vacinais (vacinologia reversa).

   Para isolar anticorpos monoclonais humanos em indivíduos selecionados por sua resposta humoral de interesse, as células B de memória IgG positivas específicas contendo anticorpos contra os alvos selecionados em sua superfície são classificadas por citometria de fluxo. Como parte deste projeto, serão selecionadas células B produtoras de anticorpos que reconhecem proteínas recombinantes biotiniladas SARS-2-S conjugadas com estreptavidina marcada com fluorocromo. Essas proteínas são produzidas por transfecção de células 293F e são então purificadas. Uma estratégia alternativa consiste na ativação de células B e triagem de sobrenadantes quanto à presença de anticorpos neutralizantes específicos em ensaios de microneutralização envolvendo, por exemplo, o uso de vírus pseudotipados com SARS-2-S. Após a identificação das células B específicas, os genes das imunoglobulinas de interesse serão amplificados por PCR a partir da célula clonal para identificação das cadeias pesada e leve (lambda ou kappa), conforme métodos previamente utilizados para o isolamento de anticorpos contra o HIV (7- 10).

   As cadeias pesadas e leves amplificadas são subsequentemente clonadas no vetor de expressão por recombinação homóloga. Os anticorpos correspondentes são produzidos por transfecção de células 293F com a combinação apropriada de cadeias pesadas e leves. Após a purificação e testes de reatividade contra a proteína SARS-2-S, avaliaremos a função neutralizante para identificar e priorizar os candidatos para uma caracterização mais profunda a fim de identificar os compostos líderes.

3. BIOMARCADORES:

   Além disso, os investigadores pretendem explorar os outros agentes imunitários, células imunitárias, complemento e citocinas, com o objetivo de identificar biomarcadores preditivos de mau prognóstico. Essas análises de laboratório podem ser capazes de prever um prognóstico ruim e podem contribuir para adaptar os cuidados médicos.

   As investigações incluirão:

   • Subpopulação de linfócitos T, B e NK e subpopulação de monócitos HLA-DR estudada por citometria de fluxo.
   • o estudo do sistema complemento (C3, C4, CH50 & CH50a).
   • o estudo de citocinas e notadamente a dosagem de IL-6 e IL-10 nos Dias 1, 3 e 7 de internação do paciente.

4. HIPÓTESE DE PESQUISA E RESULTADOS ESPERADOS Os investigadores serão capazes de monitorar as respostas de anticorpos direcionadas às glicoproteínas do envelope do SARS-CoV-2 e identificar indivíduos que apresentem uma resposta imune com altos títulos de anticorpos neutralizantes direcionados ao SARS-CoV-2. Isso permitirá o isolamento de anticorpos monoclonais dos linfócitos B de memória dos pacientes para fins terapêuticos e vacinais.

   Além disso, a investigação da imunidade em pacientes com COVID-19 permitirá a identificação de biomarcadores de gravidade e piora.

5. CONDUTA DE PESQUISA

A seleção é feita com base no prontuário de cada paciente:

• que tiveram um resultado de diagnóstico positivo de COVID-19 RT-PCR
• internados há menos de 48h no CHUGA e que apresentem sintomas decorrentes da infeção.

É seguido por uma visita de inclusão durante a qual um médico investigador examina clinicamente o paciente.

Este médico verifica os critérios de inclusão e não inclusão, expõe o ensaio ao paciente e recolhe a não oposição do paciente e o consentimento da amostragem (Anexo 2). É seguido pelos testes biológicos relacionados ao cuidado, à pesquisa e à coleta de dados (ver §7.3)

As visitas de acompanhamento (visitas 2 a 8 do dia 3 ao dia 30) acontecem conforme estabelecido no calendário do estudo durante o mês seguinte à inclusão. Um médico investigador examina clinicamente o paciente, uma enfermeira faz uma coleta de sangue relacionada aos cuidados e pesquisas (biomarcadores nos dias 1, 3 e 7 e coleta biológica nos dias 1, 3, 7, 13, último dia de internação) e um assistente de pesquisa clínica faz coleta de dados. A amostra de sangue (soro e hemácias mononucleares periféricas do dia 1, 13, último dia de internação) são as amostras necessárias para os critérios primários deste estudo.

As consultas subsequentes ao dia 7 (consultas 5 a 8) só ocorrem se o paciente ainda estiver internado. Ou seja, o término da internação estabelece o término do estudo para o grupo A.

Uma visita opcional pode ocorrer para pacientes do grupo b. Acontece 2 a 6 meses após a inclusão quando o paciente é acompanhado regularmente no CHUGA e quando é agendada uma visita com coleta de sangue que possibilitaria a coleta de amostras úteis para a pesquisa.