Immuunivasteet COVID-19:lle; Neutraloivien vasta-aineiden eristäminen terapiaa ja rokotetta varten. (AcNT-COVID19)

RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. NYKYISET TIEDOT PATOLOGIASTA

   Koronavirukset ovat suuri perhe, jonka jäsenillä on yhteinen tropismi epiteelien suhteen. Ne ovat yleensä vastuussa tavallisista ja toistuvista infektioista ihmisillä, joihin liittyy akuutti ja rajoitettu hengitysteiden tulehdus. Se tosiasia, että ne ovat RNA-viruksia (mikä antaa niille tärkeän plastisuuden) ja että tietyt tyypit infektoivat eläimiä ja toiset ihmiset, selittää sen, että ne voivat olla uusien ihmisten sairauksien lähde eläinkannoista. Näin syntyi viime vuosina kaksi useissa maissa leviävää koronavirusepidemiaa: Vaikea akuutti hengitystieoireyhtymä (SARS), vuonna 2003; ja Lähi-idän hengitystieoireyhtymä (MERS) vuonna 2012. Tammikuussa 2020 on kuvattu toinen koronavirusepidemia: COVID-19-epidemia, joka liittyy SARS-CoV-2:een.

   Koronavirustautina 2019 (COVID-19) mainittu tauti on todettu ensimmäistä kertaa Kiinassa joulukuussa 2019; ensimmäinen tapausklusteri liittyi vahvasti elävien eläinten markkinoihin, mikä viittaa eläinperäiseen alkuperään; seuraavat kuvaukset osoittivat selvästi ihmisestä ihmiseen tapahtuvan tartunnan lisääntymisluvulla (R0) välillä 2,5 - 3,5. Joissakin tieteellisissä julkaisuissa kuvattiin oireettomien koehenkilöiden mahdollista kontaminaatiota. Vaikka Kiina onnistui vihdoin kirjaamaan päivittäisten tapausten määrän huomattavan laskun (82 241 tapausta yhteensä ja 3 309 kuolemaa 31. maaliskuuta 2020), epidemia saavutti nopeasti monia muita maita. Ranskassa useat aktiivisen viruksen leviämispaikat (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) johtivat lopulta epidemian merkittävään kehitykseen Ranskassa (44 450 tapausta ja 3 024 kuolemaa 31. maaliskuuta 2020).

   Sairaus koostuu keuhkokuumeesta, joka muistuttaa useilta osin akuuttia hengitysvaikeusoireyhtymää (ARDS); 5 päivän itämisajan mediaanin jälkeen oireet kehittyvät yskällä, joka voi olla kuumeista/kuumeista ja joka voi kehittyä/kehittyä kohti hengenahdistusta ja joissakin tapauksissa kohti ARDS:ää 7-10 päivän evoluution jälkeen. Jos ensimmäiset epidemiologiset kuvaukset ilmoittivat suuren osuuden vakavista tapauksista (yli 33 %), yli 70 000 tapausta käsittävä tutkimus ehdotti sitten, että 15 % tapauksista oli vakavia/merkittyjä ja 5 % kriittisiä; Uusien tutkimusten mukaan on kuitenkin todennäköistä, että oireettomia tai vähäoireisia tapauksia voi olla useita. Tähän mennessä mikään parantava viruslääkitys ei ole osoittanut kliinistä tehoa, mutta monet kliiniset tutkimukset ovat käynnissä. Tämä sairaus on terveydenhuoltojärjestelmän ongelma kahdesta syystä: sen tarttuvuus (joka vaatii suuria sosiaalisia etäisyyksiä) ja sairastuvuus (joka lamauttaa terveydenhuoltojärjestelmän vaatimalla liian paljon teho-osaston sairaalahoitoa).

2. IMMUUNIVASTEET COVID-19:N TIEDON KUVAUSSA:

   Tämän tutkimuksen päätavoitteena on siksi tutkia vasta-ainevasteita SARS-CoV-2-infektiossa ja tarkasti tunnistaa ja tuottaa neutraloivia monoklonaalisia vasta-aineita terapeuttista ja rokotekäyttöä varten.

   SARS-tartunnan saaneilla potilailla vasta-ainevasteet ilmaantuvat yleensä aikaisin, kahden viikon aikana ensimmäisten oireiden jälkeen ja kestävät vähintään 16 kuukautta taudin alkamisen jälkeen. Neutraloivat vasteet ilmaantuvat myös aikaisin, mutta yleensä heikkenevät nopeasti 16 kuukauden kuluttua. Mielenkiintoista on, että on osoitettu, että SARS-CoV:hen kohdistuvat vasta-aineet pystyvät neutraloimaan SARS-CoV-2:n, mikä viittaa neutraloivien vasta-aineiden olemassaoloon (3). Tämä voidaan selittää suhteellisen korkealla säilyvyydellä näiden kahden viruksen välillä, jotka ympäröivät glykoproteiineja (noin 77 % sekvenssihomologiasta, hyvin samanlainen rakenne ja saman solureseptorin ACE2 käyttö), jotka ovat neutraloivien vasta-aineiden kohteita. MERS-CoV-infektion aikana on myös osoitettu, että vasta-ainevasteet ilmaantuvat infektion toisella viikolla ja kestävät vähintään 18 kuukautta. Neutraloiva vaste anti-MERS-CoV:lle on kuvattu: potilaiden viruskuorma on kääntäen verrannollinen neutraloiviin Ab-tasoihin. Ne neutraloivat vasta-aineet eivät yksin riitä infektion poistamiseen (4). Mielenkiintoista on, että suojaava vasta-ainevaste muita koronaviruksia, kuten OC43:a ja 229E:tä, vastaan ​​vaikuttaa ajallisesti paljon rajallisemmalta (5).

   Vasta-ainevasteen karakterisointi COVID-19:n aikana, erityisesti neutraloivan aktiivisuuden, on tärkeää edistymisen kannalta, jonka se mahdollistaa:

   • Ymmärtää mahdollisesti suojaavan humoraalisen vasteen luonnetta ja kestoa SARS-CoV-2-infektion aikana ja sen jälkeen
   • Tutkia IgM- ja IgG-vasta-ainevasteiden kehittymistä SARS-CoV-2-pinnan glykoproteiineja, erityisesti piikkiproteiinia (SARS2-S) vastaan
   • Tutkia neutraloivien vasta-ainevasteiden kehitystä. Itse asiassa on olennaista ymmärtää paremmin, missä määrin vahva humoraalinen immuniteetti muodostuu kaikissa tartunnan saaneissa potilaissa, jos tämä vaste vaihtelee infektion vakavuuden ja keston mukaan.
   • Potilaiden seerumien seulomiseen etsitään yksilöitä, joilla on korkea neutralointitiitterit ja ehkä neutraloivia vasta-aineita eri koronaviruksia vastaan. On tärkeää ymmärtää, pystyvätkö jotkut potilaat tuottamaan neutraloivia vasta-aineita, jotka pystyvät neutraloimaan erilaisia ​​koronaviruksia.
   • Tutkia mahdollisen virusinfektion mahdollista vasta-aineita. Itse asiassa vasta-aineiden välittämää tarttuvuuden lisääntymistä on kuvattu muille koronaviruksille, ja rokotteen kehittäminen voisi olla haastavampaa (6).

   Tämän karakterisoinnin jälkeen tutkijat pystyvät eristämään ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita valituista potilaista. Vasta-aineiden eristäminen voisi erityisesti mahdollistaa terapeuttiset ja rokotusmenetelmät tulevaisuudessa, jotta voidaan hoitaa ja ehkäistä COVID-19:n lisäksi myös muita jo olemassa olevia koronavirusinfektioita tai uuden koronavirusepidemian ilmetessä.

   Siten lupaavimmat monoklonaaliset vasta-aineet (korkea affiniteetti, korkea neutralointikyky) valitaan ja optimoidaan tulevaa kehitystä varten terapeuttisiksi aineiksi (lyijyyhdisteet).

   Loppujen lopuksi tutkijat voivat käyttää eristettyjä monoklonaalisia vasta-aineita työkaluina rakenteellisissa lähestymistavoissa neutralointiepitooppien määrittämisessä ja rokotelähestymistapojen kehittämisessä (käänteinen rokotus).

   Ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseksi yksilöistä, jotka on valittu niiden kiinnostavan humoraalisen vasteen perusteella, spesifiset IgG-positiiviset muisti-B-solut, joissa on vasta-aineita valittuja kohteita vastaan ​​niiden pinnalla, lajitellaan virtaussytometrian avulla. Osana tätä projektia lajitellaan B-soluja, jotka tuottavat vasta-aineita, jotka tunnistavat SARS-2-S-biotinyloituja rekombinanttiproteiineja, jotka on konjugoitu fluorokromileimattuun streptavidiiniin. Nämä proteiinit tuotetaan transfektoimalla 293F-soluja ja puhdistetaan sitten. Vaihtoehtoinen strategia koostuu B-solujen aktivoimisesta ja supernatanttien seulomisesta spesifisten neutraloivien vasta-aineiden läsnäolon suhteen mikroneutralointimäärityksissä, joihin sisältyy esimerkiksi SARS-2-S:llä pseudotyyppisten virusten käyttö. Kun spesifiset B-solut on tunnistettu, kiinnostavat immunoglobuliinigeenit monistetaan PCR:llä klonaalisista soluista raskaan ja kevyen (lambda- tai kappa-)ketjun tunnistamiseksi aiemmin HIV-vasta-aineiden eristämiseen käytettyjen menetelmien mukaisesti (7- 10).

   Monistetut raskaat ja kevyet ketjut kloonataan tämän jälkeen ekspressiovektoriin homologisella rekombinaatiolla. Vastaavat vasta-aineet tuotetaan 293F-solutransfektiolla sopivalla raskaiden ja kevyiden ketjujen yhdistelmällä. Puhdistuksen ja SARS-2-S-proteiinin reaktiivisuustestauksen jälkeen arvioimme neutraloivan toiminnan tunnistaaksemme ja priorisoidaksemme ehdokkaat syvempään karakterisointiin lyijyyhdisteiden tunnistamiseksi.

3. BIOMAMERKKIT:

   Lisäksi tutkijat pyrkivät tutkimaan muita immuniteettipelaajia, immuunisoluja, komplementteja ja sytokiinejä tavoitteenaan tunnistaa huonon ennusteen ennustavia biomarkkereita. Nämä laboratorioanalyysit voisivat ennustaa huonon ennusteen, ja ne voivat myötävaikuttaa sairaanhoidon mukauttamiseen.

   Tutkimuksiin kuuluvat:

   • T-, B- ja NK-lymfosyyttien alapopulaatio ja monosyyttien HLA-DR-alapopulaatio tutkittu virtaussytometrisesti.
   • komplementtijärjestelmän (C3, C4, CH50 & CH50a) tutkimus.
   • sytokiinien tutkimus ja erityisesti IL-6:n ja IL-10:n mittaus potilaiden sairaalahoidon päivinä 1, 3 ja 7.

4. TUTKIMUKSEN HYPOTEESI JA ODOTETUT TULOKSET Tutkijat pystyvät seuraamaan vasta-ainevasteita, jotka kohdistuvat SARS-CoV-2:n vaippaglykoproteiineihin, ja tunnistamaan henkilöt, joilla on immuunivaste ja joilla on korkea SARS-CoV-2:een kohdistuvien neutraloivien vasta-aineiden tiitterit. Tämä mahdollistaa monoklonaalisten vasta-aineiden eristämisen potilaiden muisti-B-lymfosyyteistä hoito- ja rokotetarkoituksiin.

   Lisäksi COVID-19-potilaiden immuniteettitutkimus mahdollistaa vakavuuden ja pahenevien biomarkkerien tunnistamisen.

5. TUTKIMUKSEN SUORITUS

Valinta tehdään jokaisen potilaan sairauskertomuksen perusteella:

• joilla oli positiivinen diagnostinen tulos COVID-19 RT-PCR:stä
• sairaalahoidossa alle 48 tuntia CHUGAssa ja joilla on infektion aiheuttamia oireita.

Sitä seuraa inkluusiokäynti, jonka aikana tutkiva lääkäri tutkii potilaan kliinisesti.

Tämä lääkäri tarkistaa sisällyttämis- ja kieltäytymiskriteerit, esittelee tutkimuksen potilaalle ja kerää potilaan kieltäytymisluvan ja näytteenottosuostumuksen (Liite 2). Sitä seuraavat hoitoon, tutkimukseen ja tiedonkeruuun liittyvät biologiset testit (ks. §7.3).

Seurantakäynnit (käynnit 2–8 päivästä 3 päivään 30) tapahtuvat tutkimuskalenterin mukaisesti sisällyttämistä seuraavan kuukauden aikana. Tutkiva lääkäri tutkii potilaan kliinisesti, sairaanhoitaja tekee hoitoon ja tutkimukseen liittyvät verinäytteet (biomarkkerit päivinä 1, 3 ja 7 ja biologiset keräykset päivinä 1, 3, 7, 13, viimeinen sairaalahoitopäivä) ja kliinisen tutkimuksen assistentti kerää tietoja. Verinäyte (seerumi ja perifeeriset mononukleaariset verisolut päivästä 1, 13, viimeinen sairaalahoitopäivä) ovat tämän tutkimuksen ensisijaisia ​​kriteerejä varten tarvittavat näytteet.

Päivän 7 jälkeiset käynnit (käynnit 5-8) tapahtuvat vain, jos potilas on edelleen sairaalahoidossa. Toisin sanoen sairaalahoidon päättyminen merkitsee A-ryhmän tutkimuksen päättymistä.

Valinnainen käynti voidaan järjestää B-ryhmän potilaille. Se tapahtuu 2-6 kuukautta sisällyttämisen jälkeen, kun potilasta seurataan säännöllisesti CHUGAssa ja kun on sovittu käynti verinäytteiden kanssa, mikä mahdollistaisi hyödyllisten näytteiden keräämisen tutkimusta varten.