Risposte immunitarie a COVID-19; Isolamento di anticorpi neutralizzanti per terapie e vaccini. (AcNT-COVID19)

A RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. CONOSCENZE ATTUALI SULLA PATOLOGIA

   I coronavirus sono una grande famiglia i cui membri condividono un tropismo per gli epiteli. Sono solitamente responsabili di infezioni ordinarie e frequenti nell'uomo, con infiammazioni acute e limitate delle vie respiratorie. Il fatto che si tratti di virus a RNA (il che conferisce loro un'importante plasticità), e che alcuni tipi infettino gli animali e altri infettino l'uomo, spiegano che potrebbero essere una fonte di nuove malattie umane derivanti da ceppi animali. È così che negli ultimi anni sono emerse due epidemie di Coronavirus diffuse in diversi Paesi: la Sindrome respiratoria acuta grave (SARS), nel 2003; e la sindrome respiratoria mediorientale (MERS) nel 2012. Nel gennaio 2020 è stato descritto un altro focolaio di coronavirus: l'epidemia di COVID-19, correlata al SARS-CoV-2.

   La malattia indicata come malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) è stata rilevata per la prima volta in Cina nel dicembre 2019; un primo cluster di casi era fortemente correlato a un mercato di animali vivi, suggerendo un'origine animale; le seguenti descrizioni hanno chiaramente stabilito una trasmissione da uomo a uomo, con un numero di riproduzione (R0) compreso tra 2,5 e 3,5. Alcune pubblicazioni scientifiche descrivono potenziali contaminazioni da parte di soggetti asintomatici. Mentre la Cina è finalmente riuscita a registrare una forte diminuzione del numero di casi giornalieri (82.241 casi totali con 3.309 morti al 31 marzo 2020), l'epidemia ha raggiunto rapidamente molti altri paesi. In Francia, diversi siti di circolazione attiva del virus (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) hanno finalmente portato a un importante sviluppo dell'epidemia in Francia (44.450 casi con 3.024 morti al 31 marzo 2020).

   La malattia consiste in una polmonite che ricorda per diversi aspetti la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS); dopo un tempo medio di incubazione di 5 giorni, i sintomi si sviluppano con tosse che può essere febbrile/febbrile, e che può evolvere/svilupparsi verso la dispnea, e in alcuni casi verso l'ARDS dopo 7-10 giorni di evoluzione. Se le prime descrizioni epidemiologiche indicavano un'alta percentuale di casi gravi (oltre il 33%), uno studio comprendente più di 70.000 casi ha poi suggerito che il 15% dei casi erano gravi/marcati e il 5% critici; tuttavia, è probabile che i casi asintomatici o poco sintomatici possano essere numerosi, secondo nuovi studi. Ad oggi, nessun trattamento antivirale curativo ha dimostrato efficacia clinica, ma sono in corso molti studi clinici. Questa malattia è un problema per il sistema sanitario per due motivi: la sua contagiosità (che richiede importanti misure di distanziamento sociale) e la sua morbilità (che paralizza il sistema sanitario richiedendo troppi ricoveri in terapia intensiva).

2. RISPOSTE IMMUNITARIE NELLO STATO DELL'ARTE DEL COVID-19:

   Lo scopo principale di questo studio è quindi quello di esplorare le risposte anticorpali nell'infezione da SARS-CoV-2 e di identificare e quindi produrre anticorpi monoclonali neutralizzanti per uso terapeutico e vaccinale.

   Nei pazienti con infezione da SARS, le risposte anticorpali compaiono solitamente precocemente, nelle due settimane successive ai primi sintomi e durano per almeno 16 mesi dopo l'inizio della malattia. Anche le risposte neutralizzanti compaiono presto, ma tendono a diminuire rapidamente dopo 16 mesi. È interessante notare che è stato dimostrato che gli anticorpi diretti contro SARS-CoV sono in grado di neutralizzare SARS-CoV-2, suggerendo l'esistenza di anticorpi neutralizzanti (3). Ciò potrebbe essere spiegato dalla conservazione relativamente elevata tra i due virus che avvolgono le glicoproteine ​​(circa il 77% di omologia di sequenza, una struttura molto simile e l'uso dello stesso recettore cellulare ACE2), che sono i bersagli degli anticorpi neutralizzanti. Durante l'infezione da MERS-CoV, è stato anche dimostrato che le risposte anticorpali compaiono nella seconda settimana di infezione e durano per almeno 18 mesi. È stata descritta una risposta neutralizzante anti-MERS-CoV: la carica virale dei pazienti è inversamente proporzionale ai livelli di anticorpi neutralizzanti. Quegli anticorpi neutralizzanti da soli non sono sufficienti per eliminare l'infezione (4). È interessante notare che la risposta anticorpale protettiva contro altri coronavirus come OC43 e 229E sembra molto più limitata nel tempo (5).

   Una caratterizzazione della risposta anticorpale durante COVID-19, in particolare l'attività neutralizzante, è importante per il progresso che consentirà:

   • Comprendere la natura e la durata della risposta umorale potenzialmente protettiva durante e dopo l'infezione da SARS-CoV-2
   • Studiare l'evoluzione delle risposte anticorpali IgM e IgG contro le glicoproteine ​​di superficie SARS-CoV-2, in particolare la proteina spike (SARS2-S)
   • Studiare l'evoluzione delle risposte anticorpali neutralizzanti. Infatti, è essenziale capire meglio in che misura si genera una forte immunità umorale in tutti i pazienti infetti, se questa risposta varia in funzione della gravità e della durata dell'infezione.
   • Per esaminare i sieri dei pazienti alla ricerca di individui che mostrano titoli di neutralizzazione elevati e forse per neutralizzare gli anticorpi contro diversi coronavirus. È fondamentale capire se alcuni pazienti possono produrre anticorpi neutralizzanti, in grado di neutralizzare diversi coronavirus.
   • Studiare l'esistenza di una potenziale facilitazione dell'infezione virale da parte degli anticorpi. In effetti, l'aumento dell'infettività mediata dagli anticorpi è stato descritto per altri coronavirus e potrebbe rendere più impegnativo lo sviluppo del vaccino (6).

   A seguito di questa caratterizzazione, i ricercatori saranno in grado di isolare anticorpi monoclonali umani da pazienti selezionati. L'isolamento degli anticorpi potrebbe in particolare consentire approcci terapeutici e vaccinali in futuro, per trattare e prevenire non solo il COVID-19, ma anche altre infezioni da coronavirus già esistenti o in caso di un nuovo focolaio di coronavirus.

   Pertanto, gli anticorpi monoclonali più promettenti (alta affinità, alta capacità neutralizzante) saranno selezionati e ottimizzati per un futuro sviluppo come agenti terapeutici (composti di piombo).

   Infine, i ricercatori saranno in grado di utilizzare anticorpi monoclonali isolati come strumenti in approcci strutturali per la determinazione degli epitopi di neutralizzazione e lo sviluppo di approcci vaccinali (reverse vaccinology).

   Al fine di isolare anticorpi monoclonali umani in individui selezionati per la loro risposta umorale di interesse, le specifiche cellule B di memoria IgG positive che portano anticorpi contro i bersagli selezionati sulla loro superficie, vengono selezionate mediante citometria a flusso. Come parte di questo progetto, le cellule B che producono anticorpi che riconoscono le proteine ​​ricombinanti biotinilate SARS-2-S coniugate con streptavidina marcata con fluorocromo saranno selezionate. Queste proteine ​​sono prodotte dalla trasfezione delle cellule 293F e vengono quindi purificate. Una strategia alternativa consiste nell'attivare le cellule B e nello screening dei surnatanti per la presenza di anticorpi neutralizzanti specifici in saggi di microneutralizzazione che comportano ad esempio l'uso di virus pseudotipizzati con SARS-2-S. Dopo aver identificato le cellule B specifiche, i geni immunoglobulinici di interesse saranno amplificati mediante PCR da cellula clonale al fine di identificare le catene pesanti e leggere (lambda o kappa), in accordo con metodi precedentemente utilizzati per l'isolamento di anticorpi contro l'HIV (7- 10).

   Le catene pesanti e leggere amplificate vengono successivamente clonate nel vettore di espressione mediante ricombinazione omologa. Gli anticorpi corrispondenti sono prodotti dalla trasfezione cellulare 293F con l'appropriata combinazione di catene pesanti e leggere. Dopo la purificazione e il test di reattività contro la proteina SARS-2-S, valuteremo la funzione neutralizzante per identificare e dare priorità ai candidati per una caratterizzazione più approfondita al fine di identificare i composti principali.

3. BIOMARCATORI:

   Inoltre, i ricercatori mirano a esplorare gli altri attori dell'immunità, cellule immunitarie, complemento e citochine, con l'obiettivo di identificare biomarcatori predittivi di una prognosi infausta. Queste analisi di laboratorio potrebbero essere in grado di prevedere una prognosi infausta e potrebbero contribuire ad adattare le cure mediche.

   Le indagini riguarderanno:

   • Sottopopolazione di linfociti T, B e NK e sottopopolazione di monociti HLA-DR studiata mediante citometria a flusso.
   • lo studio del sistema del complemento (C3, C4, CH50 e CH50a).
   • lo studio delle citochine e in particolare la misurazione di IL-6 e IL-10 ai giorni 1, 3 e 7 di ricovero del paziente.

4. IPOTESI DI RICERCA E RISULTATI ATTESI I ricercatori saranno in grado di monitorare le risposte anticorpali mirate alle glicoproteine ​​dell'involucro di SARS-CoV-2 e identificare i soggetti che mostrano una risposta immunitaria con titoli elevati di anticorpi neutralizzanti mirati a SARS-CoV-2. Ciò consentirà l'isolamento di anticorpi monoclonali dai linfociti B della memoria dei pazienti per scopi terapeutici e vaccinali.

   Inoltre, l'indagine sull'immunità nei pazienti COVID-19 consentirà l'identificazione della gravità e del peggioramento dei biomarcatori.

5. CONDOTTA DI RICERCA

La selezione avviene sulla base della cartella clinica di ogni paziente:

• che hanno avuto un risultato diagnostico positivo di COVID-19 RT-PCR
• ricoverati da meno di 48h presso il CHUGA e che presentano sintomi conseguenti all'infezione.

Segue una visita di inclusione durante la quale un medico inquirente esamina clinicamente il paziente.

Tale medico verifica i criteri di inclusione e non inclusione, espone la sperimentazione al paziente e raccoglie il consenso di non opposizione e campionamento del paziente (Appendice 2). Seguono i test biologici relativi alla cura, alla ricerca e alla raccolta dei dati (vedi §7.3)

Le visite di follow-up (visite da 2 a 8 dal giorno 3 al giorno 30) avvengono come stabilito nel calendario di studio nel mese successivo all'inclusione. Un medico inquirente esamina clinicamente il paziente, un infermiere esegue quindi il prelievo di sangue relativo alla cura e alla ricerca (biomarcatori al giorno 1, 3 e 7 e raccolta biologica al giorno 1, 3, 7, 13, ultimo giorno di ricovero) e un assistente di ricerca clinica esegue la raccolta dei dati. Il campione di sangue (siero e globuli mononucleati periferici dal giorno 1, 13, ultimo giorno di ricovero) sono i campioni necessari per i criteri primari di questo studio.

Le visite successive al giorno 7 (visite da 5 a 8) avvengono solo se il paziente è ancora ricoverato. In altre parole, la fine del ricovero sancisce la fine dello studio per il gruppo A.

Per i pazienti del gruppo b può essere effettuata una visita facoltativa. Avviene da 2 a 6 mesi dopo l'inserimento quando il paziente viene regolarmente seguito presso il CHUGA e quando viene programmata una visita con prelievi ematici che consenta il prelievo di campioni utili alla ricerca.