Immunsvar mot covid-19; Isolering av neutraliserande antikroppar för terapi och vaccin. (AcNT-COVID19)

EN RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. AKTUELL KUNSKAP OM PATOLOGIN

   Coronavirus är en stor familj vars medlemmar delar en tropism för epitel. De är vanligtvis ansvariga för vanliga och frekventa infektioner hos människor, med akut och begränsad inflammation i luftvägarna. Det faktum att de är RNA-virus (vilket ger dem en viktig plasticitet), och att vissa typer infekterar djur och andra infekterar människor, förklarar att de kan vara en källa till nya mänskliga sjukdomar som härrör från djurstammar. Så här uppstod två koronavirusutbrott som spred sig i flera länder under de senaste åren: The Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), 2003; och Middle East Respiratory Syndrome (MERS) 2012. I januari 2020 har ett annat coronavirusutbrott beskrivits: COVID-19-utbrottet, relaterat till SARS-CoV-2.

   Sjukdomen som nämns som coronavirus sjukdom 2019 (COVID-19) har upptäckts för första gången i Kina i december 2019; ett första fall-kluster var starkt relaterat till en marknad för levande djur, vilket tyder på ett animaliskt ursprung; Följande beskrivningar fastställde tydligt en överföring från människa till människa, med ett reproduktionsnummer (R0) mellan 2,5 och 3,5. Vissa vetenskapliga publikationer beskrev potentiella kontaminationer av asymtomatiska försökspersoner. Medan Kina äntligen lyckades registrera en stor minskning av antalet dagliga fall (82 241 totalt fall med 3 309 dödsfall den 31 mars 2020), nådde epidemin snabbt många andra länder. I Frankrike ledde flera platser för aktiv viruscirkulation (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) slutligen till en viktig utveckling av epidemin i Frankrike (44 450 fall med 3 024 dödsfall den 31 mars 2020).

   Sjukdomen består i en lunginflammation som påminner om Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) i flera aspekter; efter 5 dagars medianinkubationstid utvecklas symtom med hosta som kan vara febril/feberaktig, och som kan utvecklas/utvecklas mot dyspné, och i vissa fall mot ARDS efter 7 till 10 dagars utveckling. Om de första epidemiologiska beskrivningarna angav en hög andel allvarliga fall (mer än 33 %), antydde en studie som inkluderade mer än 70 000 fall att 15 % av fallen var allvarliga/markerade och 5 % kritiska; men det är troligt att asymtomatiska eller lite symtomatiska fall kan vara många, enligt nya studier. Hittills har ingen botande antiviral behandling visat klinisk effekt men många kliniska prövningar pågår. Denna sjukdom är ett problem för sjukvården av två skäl: dess smittsamhet (som kräver stora sociala distansåtgärder) och dess sjuklighet (som förlamar sjukvården genom att kräva för mycket intensivvård på sjukhus).

2. IMMUNA SVAR I COVID-19 STATUS:

   Huvudsyftet med denna studie är därför att undersöka antikroppssvaren vid SARS-CoV-2-infektion och i detalj identifiera och sedan producera neutraliserande monoklonala antikroppar för terapeutisk användning och vaccinanvändning.

   Hos SARS-infekterade patienter uppträder antikroppssvar vanligtvis tidigt, under de två veckorna efter de första symtomen och varar i minst 16 månader efter att sjukdomen började. Neutraliserande svar uppträder också tidigt, men tenderar att avta snabbt efter 16 månader. Intressant nog har det visats att antikroppar som riktar sig mot SARS-CoV kan neutralisera SARS-CoV-2, vilket tyder på att det finns neutraliserande antikroppar (3). Detta kan förklaras av den relativt höga konserveringen mellan de två virusen omsluter glykoproteiner (cirka 77 % av sekvenshomologin, en mycket liknande struktur och användningen av samma cellulära receptor ACE2), som är målen för neutraliserande antikroppar. Under MERS-CoV-infektion har det också visat sig att antikroppssvar uppträder under den andra infektionsveckan och varar under minst 18 månader. Ett neutraliserande svar anti-MERS-CoV har beskrivits: den virala belastningen hos patienter är omvänt proportionell mot de neutraliserande Ab-nivåerna. Dessa neutraliserande antikroppar ensamma är inte tillräckliga för infektionsclearing (4). Intressant nog verkar det skyddande antikroppssvaret mot andra coronavirus som OC43 och 229E mycket mer tidsbegränsat (5).

   En karakterisering av antikroppssvaret under COVID-19, särskilt den neutraliserande aktiviteten, är viktig för de framsteg som det kommer att möjliggöra:

   • För att förstå arten och varaktigheten av det potentiellt skyddande humorala svaret under och efter infektionen av SARS-CoV-2
   • Att studera utvecklingen av IgM- och IgG-antikroppssvar mot SARS-CoV-2 ytglykoproteiner, särskilt spikproteinet (SARS2-S)
   • Att studera evolutionen av neutraliserande antikroppssvar. Det är faktiskt väsentligt att bättre förstå i vilken utsträckning en stark humoral immunitet genereras hos alla infekterade patienter, om detta svar varierar i enlighet med infektionens svårighetsgrad och varaktighet.
   • Att screena patienters sera som letar efter individer som visar höga neutralisationstitrar och kanske för att neutralisera antikroppar mot olika coronavirus. Det är viktigt att förstå om vissa patienter kan producera neutraliserande antikroppar som kan neutralisera olika coronavirus.
   • Att studera förekomsten av en potentiell virusinfektion som underlättas av antikroppar. Faktum är att ökningen av smittsamhet medierad av antikroppar har beskrivits för andra coronavirus och kan utveckla vaccinet mer utmanande (6).

   Efter denna karakterisering kommer utredarna att kunna isolera humana monoklonala antikroppar från utvalda patienter. Antikroppsisolering kan särskilt möjliggöra terapeutiska metoder och vaccinationer i framtiden, för att behandla och förebygga inte bara covid-19, utan även andra redan existerande coronavirusinfektioner eller i händelse av ett nytt coronavirusutbrott.

   Således kommer de mest lovande monoklonala antikropparna (hög affinitet, hög neutraliserande kapacitet) att väljas ut och optimeras för en framtida utveckling som terapeutiskt medel (blyföreningar).

   I stora drag kommer utredarna att kunna använda isolerade monoklonala antikroppar som verktyg i strukturella tillvägagångssätt för bestämning av neutraliseringsepitoper och utveckling av vaccinmetoder (omvänd vaccinologi).

   För att isolera humana monoklonala antikroppar i individer utvalda för deras humorala svar av intresse, sorteras de specifika IgG-positiva minnes-B-cellerna som bär antikroppar mot de utvalda målen vid deras yta genom flödescytometri. Som en del av detta projekt kommer B-celler som producerar antikroppar som känner igen SARS-2-S biotinylerade rekombinanta proteiner konjugerade till fluorokrommärkt streptavidin att sorteras. Dessa proteiner produceras genom transfektion av 293F-celler och renas sedan. En alternativ strategi består i att aktivera B-celler och screena supernatanter med avseende på närvaron av specifika neutraliserande antikroppar i mikroneutraliseringsanalyser som innefattar till exempel användning av virus pseudotypade med SARS-2-S. Efter identifiering av de specifika B-cellerna kommer immunoglobulingenerna av intresse att amplifieras med PCR från klonala celler för att identifiera de tunga och lätta (lambda eller kappa) kedjorna, i enlighet med metoder som tidigare använts för isolering av antikroppar mot HIV (7- 10).

   Amplifierade tunga och lätta kedjor klonas därefter i expressionsvektor genom homolog rekombination. Motsvarande antikroppar produceras genom 293F-celltransfektion med lämplig kombination av tunga och lätta kedjor. Efter rening och reaktivitetstestning mot SARS-2-S-protein, kommer vi att utvärdera neutraliserande funktion för att identifiera och prioritera kandidaterna för en djupare karakterisering för att identifiera ledande föreningar.

3. BIOMARKÄRER:

   Dessutom syftar utredarna till att utforska andra immunitetsspelare, immunceller, komplement och cytokiner, i syfte att identifiera prediktiva biomarkörer för en dålig prognos. Dessa labbanalyser skulle kunna förutsäga dålig prognos och kan bidra till att anpassa sjukvården.

   Utredningarna kommer att omfatta:

   • T-, B- och NK-lymfocytsubpopulation och monocyt-HLA-DR-subpopulation studerade med flödescytometri.
   • studien av komplementsystem (C3, C4, CH50 & CH50a).
   • studien av cytokiner och särskilt mätningen av IL-6 och IL-10 vid dag 1, 3 och 7 av patientens sjukhusvistelse.

4. FORSKNINGSHYPOTES OCH FÖRVÄNTADE RESULTAT Utredarna kommer att kunna övervaka antikroppssvar riktade mot höljesglykoproteinerna av SARS-CoV-2 och identifiera försökspersoner som visar ett immunsvar med höga titrar av neutraliserande antikroppar riktade mot SARS-CoV-2. Detta kommer att möjliggöra isolering av monoklonala antikroppar från patientens minne B-lymfocyter för terapeutiska ändamål och vaccinändamål.

   Dessutom kommer immunitetsutredningen hos COVID-19-patienter att möjliggöra identifiering av svårighetsgrad och försämrade biomarkörer.

5. FORSKNINGSUPPFÖRANDE

Urvalet görs baserat på journalen för varje patient:

• som hade ett positivt diagnostiskt resultat av COVID-19 RT-PCR
• inlagda på sjukhus i mindre än 48 timmar på CHUGA och som har symtom till följd av infektionen.

Det följs av ett inklusionsbesök under vilket en utredande läkare kliniskt undersöker patienten.

Denna läkare kontrollerar inklusions- och icke-inklusionskriterierna, exponerar prövningen för patienten och samlar in patientens icke-opposition och provtagningssamtycke (bilaga 2). Den följs av de biologiska testerna relaterade till vård, forskning och datainsamling (se §7.3)

Uppföljningsbesöken (besök 2 till 8 från dag 3 till dag 30) sker som fastställts i studiekalendern under månaden efter inkluderingen. En utredande läkare undersöker patienten kliniskt, en sjuksköterska tar sedan blodprover relaterat till vård och forskning (biomarkörer vid dag 1, 3 och 7 och biologisk insamling dag 1, 3, 7, 13, sista inläggningsdagen) och en klinisk forskningsassistent gör datainsamling. Blodprovet (serum och perifera mononukleära blodkroppar från dag 1, 13, sista sjukhusinläggningsdagen) är de prover som är nödvändiga för de primära kriterierna för denna studie.

Besöken efter dag 7 (besök 5 till 8) sker endast om patienten fortfarande är inlagd på sjukhus. Med andra ord fastställer slutet av sjukhusvistelsen slutet på studien för grupp A.

Ett valfritt besök kan ske för grupp b patienter. Det händer 2 till 6 månader efter inkluderingen när patienten regelbundet följs upp på CHUGA och när ett besök med blodprovstagning planeras som skulle möjliggöra insamling av användbara prover för forskningen.