Immunresponser på covid-19; Isolering av nøytraliserende antistoffer for terapi og vaksine. (AcNT-COVID19)

EN RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. AKTUELL KUNNSKAP OM PATOLOGIEN

   Koronavirus er en stor familie hvis medlemmer deler en tropisme for epitel. De er vanligvis ansvarlige for vanlige og hyppige infeksjoner hos mennesker, med akutt og begrenset betennelse i luftveiene. Det faktum at de er RNA-virus (som gir dem en viktig plastisitet), og at noen typer infiserer dyr og andre infiserer mennesker, forklarer at de kan være en kilde til nye menneskelige sykdommer som stammer fra dyrestammer. Dette er hvordan to koronavirusutbrudd som spredte seg i flere land dukket opp de siste årene: The Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), i 2003; og Midtøstens luftveissyndrom (MERS) i 2012. I januar 2020 ble et annet koronavirusutbrudd beskrevet: COVID-19-utbruddet, relatert til SARS-CoV-2.

   Sykdommen nevnt som koronavirussykdom 2019 (COVID-19) ble oppdaget for første gang i Kina i desember 2019; en første case-klynge var sterkt relatert til et marked for levende dyr, noe som tyder på en animalsk opprinnelse; Følgende beskrivelser etablerte tydelig en menneske-til-menneske overføring, med et reproduksjonstall (R0) mellom 2,5 og 3,5. Noen vitenskapelige publikasjoner beskrev potensielle forurensninger fra asymptomatiske personer. Mens Kina endelig klarte å registrere en stor nedgang i antall daglige tilfeller (82 241 totale tilfeller med 3 309 dødsfall den 31. mars 2020), nådde epidemien raskt mange andre land. I Frankrike førte flere steder med aktiv virussirkulasjon (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) til slutt til en viktig utvikling av epidemien i Frankrike (44 450 tilfeller med 3 024 dødsfall 31. mars 2020).

   Sykdommen består i en lungebetennelse som minner om Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) i flere aspekter; etter 5 dagers median inkubasjonstid utvikler det seg symptomer med hoste som kan være febril/feberaktig, og som kan utvikle seg mot dyspné, og i noen tilfeller mot ARDS etter 7 til 10 dagers utvikling. Hvis de første epidemiologiske beskrivelsene anga en høy andel alvorlige tilfeller (mer enn 33 %), antydet en studie som inkluderte mer enn 70 000 tilfeller at 15 % var alvorlige/markerte og 5 % kritiske; Det er imidlertid sannsynlig at asymptomatiske eller lite symptomatiske tilfeller kan være mange, ifølge nye studier. Til dags dato har ingen kurativ antiviral behandling vist klinisk effekt, men mange kliniske studier pågår. Denne sykdommen er et problem for helsevesenet av to grunner: dens smitteevne (som krever store sosiale distanserende tiltak) og dens sykelighet (som lammer helsevesenet ved å kreve for mye sykehusinnleggelse på intensivavdelingen).

2. IMMUNE RESPONS I COVID-19 STATE OF ART:

   Hovedformålet med denne studien er derfor å utforske antistoffresponsene ved SARS-CoV-2-infeksjon og i detalj identifisere og deretter produsere nøytraliserende monoklonale antistoffer for terapeutisk bruk og vaksinebruk.

   Hos SARS-infiserte pasienter vises antistoffresponser vanligvis tidlig, i de to ukene etter de første symptomene og varer i minst 16 måneder etter at sykdommen startet. Nøytraliserende responser vises tidlig også, men har en tendens til å avta raskt etter 16 måneder. Interessant nok har det blitt vist at antistoffer rettet mot SARS-CoV er i stand til å nøytralisere SARS-CoV-2, noe som tyder på at det finnes nøytraliserende antistoffer (3). Dette kan forklares av den relativt høye konserveringen mellom de to virusene omslutter glykoproteiner (omtrent 77 % av sekvenshomologien, en svært lik struktur og bruken av den samme cellulære reseptoren ACE2), som er målene for nøytraliserende antistoffer. Under MERS-CoV-infeksjon har det også blitt vist at antistoffresponser vises i den andre infeksjonsuken og varer i minst 18 måneder. En nøytraliserende respons anti-MERS-CoV er beskrevet: virusmengden til pasienter er omvendt proporsjonal med de nøytraliserende Ab-nivåene. Disse nøytraliserende antistoffene alene er ikke tilstrekkelige for infeksjonsklarering (4). Interessant nok virker den beskyttende antistoffresponsen mot andre koronavirus som OC43 og 229E mye mer begrenset i tid (5).

   En karakterisering av antistoffresponsen under COVID-19, spesielt den nøytraliserende aktiviteten, er viktig for fremgangen den vil tillate:

   • For å forstå arten og varigheten av den potensielt beskyttende humorale responsen under og etter infeksjonen med SARS-CoV-2
   • For å studere utviklingen av IgM- og IgG-antistoffresponser mot SARS-CoV-2 overflateglykoproteiner, spesielt spikeproteinet (SARS2-S)
   • For å studere evolusjon av nøytraliserende antistoffresponser. Det er faktisk viktig å bedre forstå i hvilken grad en sterk humoral immunitet genereres hos alle infiserte pasienter, hvis denne responsen varierer i henhold til infeksjonens alvorlighetsgrad og varighet.
   • For å screene pasienters sera på jakt etter individer som viser høye nøytraliseringstitre og kanskje for å nøytralisere antistoffer mot forskjellige koronavirus. Det er viktig å forstå om noen pasienter kan produsere nøytraliserende antistoffer, i stand til å nøytralisere forskjellige koronavirus.
   • For å studere eksistensen av en potensiell viral infeksjon tilrettelegging av antistoffer. Faktisk er økningen i smittsomhet mediert av antistoffer blitt beskrevet for andre koronavirus og kan vaksineutviklingen bli mer utfordrende (6).

   Etter denne karakteriseringen vil etterforskerne være i stand til å isolere humane monoklonale antistoffer fra utvalgte pasienter. Antistoffisolering kan spesielt muliggjøre terapeutiske og vaksinetilnærminger i fremtiden, for å behandle og forhindre ikke bare COVID-19, men også andre allerede eksisterende koronavirusinfeksjoner eller i tilfelle et nytt koronavirusutbrudd.

   Dermed vil de mest lovende monoklonale antistoffene (høy affinitet, høy nøytraliserende kapasitet) velges ut og optimaliseres for en fremtidig utvikling som terapeutisk middel (blyforbindelser).

   I fine, vil etterforskerne være i stand til å bruke isolerte monoklonale antistoffer som verktøy i strukturelle tilnærminger for bestemmelse av nøytraliseringsepitoper og utvikling av vaksinetilnærminger (omvendt vaksinologi).

   For å isolere humane monoklonale antistoffer i individer valgt for deres humorale respons av interesse, blir de spesifikke IgG-positive minne B-cellene som bærer antistoffer mot de valgte målene på overflaten, sortert ved hjelp av flowcytometri. Som en del av dette prosjektet vil B-celler som produserer antistoffer som gjenkjenner SARS-2-S biotinylerte rekombinante proteiner konjugert til fluorokrom-merket streptavidin sorteres. Disse proteinene produseres ved transfeksjon av 293F-celler og blir deretter renset. En alternativ strategi består i å aktivere B-celler og screene supernatanter for tilstedeværelse av spesifikke nøytraliserende antistoffer i mikronøytraliseringsanalyser som involverer for eksempel bruk av virus pseudotypet med SARS-2-S. Etter identifisering av de spesifikke B-cellene, vil immunoglobulingenene av interesse forsterkes ved PCR fra klonalcelle for å identifisere de tunge og lette (lambda eller kappa) kjedene, i henhold til metoder som tidligere ble brukt for isolering av antistoffer mot HIV (7- 10).

   Amplifiserte tunge og lette kjeder blir deretter klonet i ekspresjonsvektor ved homolog rekombinasjon. De tilsvarende antistoffene produseres ved 293F-celletransfeksjon med passende kombinasjon av tunge og lette kjeder. Etter rensing og reaktivitetstesting mot SARS-2-S-protein, vil vi evaluere nøytraliserende funksjon for å identifisere og prioritere kandidatene for en dypere karakterisering for å identifisere ledende forbindelser.

3. BIOMARKØRER:

   I tillegg har etterforskerne som mål å utforske de andre immunitetsspillerne, immunceller, komplement og cytokiner, med sikte på å identifisere prediktive biomarkører for en dårlig prognose. Disse laboratorieanalysene kan være i stand til å forutsi dårlig prognose og kan bidra til å tilpasse medisinsk behandling.

   Undersøkelsene vil omfatte:

   • T, B og NK lymfocytter subpopulasjon og monocytt HLA-DR subpopulasjon studert ved flowcytometri.
   • studiet av komplementsystem (C3, C4, CH50 & CH50a).
   • studien av cytokiner og spesielt målingen av IL-6 og IL-10 på dag 1, 3 og 7 av pasientinnleggelse.

4. FORSKNINGSHYPOTESE OG FORVENTEDE RESULTATER Etterforskerne vil være i stand til å overvåke antistoffresponser rettet mot innhyllingsglykoproteinene til SARS-CoV-2 og identifisere forsøkspersoner som viser en immunrespons med høye titere av nøytraliserende antistoffer rettet mot SARS-CoV-2. Dette vil tillate isolering av monoklonale antistoffer fra pasientenes minne B-lymfocytter for terapeutiske og vaksineformål.

   Videre vil immunitetsundersøkelsen hos COVID-19-pasienter muliggjøre identifisering av alvorlighetsgrad og forverrede biomarkører.

5. FORSKNINGSUTFØRELSE

Utvalget oppnås basert på journalen for hver pasient:

• som hadde et positivt diagnostisk resultat av COVID-19 RT-PCR
• innlagt på sykehus i mindre enn 48 timer på CHUGA og som har symptomer som følge av infeksjonen.

Det etterfølges av et inklusjonsbesøk hvor en undersøkende lege undersøker pasienten klinisk.

Denne legen sjekker inklusjons- og ikke-inklusjonskriteriene, eksponerer forsøket for pasienten og innhenter pasienten ikke-motstand og prøvetakingssamtykke (vedlegg 2). Den etterfølges av de biologiske testene knyttet til omsorg, forskning og datainnsamling (se §7.3)

Oppfølgingsbesøkene (besøk 2 til 8 fra dag 3 til dag 30) skjer som fastsatt i studiekalenderen i løpet av måneden etter inkludering. En undersøkende lege undersøker pasienten klinisk, en sykepleier tar deretter blodprøver relatert til pleie og forskning (biomarkører på dag 1, 3 og 7 og biologisk innsamling på dag 1, 3, 7, 13, siste innleggelsesdag) og en klinisk forskningsassistent gjør datainnsamling. Blodprøven (serum og perifere mononukleære blodceller fra dag 1, 13, siste innleggelsesdag) er prøvene som er nødvendige for hovedkriteriene i denne studien.

Besøkene etter dag 7 (besøk 5 til 8) skjer kun hvis pasienten fortsatt er innlagt på sykehus. Med andre ord, avslutningen av sykehusoppholdet etablerer slutten på studien for gruppe A.

Et valgfritt besøk kan finne sted for gruppe b pasienter. Det skjer 2 til 6 måneder etter inkludering når pasienten følges opp regelmessig på CHUGA og når det planlegges et besøk med blodprøvetaking som vil muliggjøre innsamling av nyttige prøver for forskningen.