Odpowiedzi immunologiczne na COVID-19; Izolacja przeciwciał neutralizujących do celów terapeutycznych i szczepionek. (AcNT-COVID19)

RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. AKTUALNA WIEDZA O PATOLOGII

   Koronawirusy to duża rodzina, której członkowie mają wspólny tropizm do nabłonków. Są one zwykle odpowiedzialne za zwykłe i częste infekcje u ludzi, z ostrym i ograniczonym stanem zapalnym dróg oddechowych. Fakt, że są to wirusy RNA (co nadaje im dużą plastyczność) oraz że niektóre typy zarażają zwierzęta, a inne zarażają ludzi, wyjaśnia, że ​​mogą one być źródłem nowych ludzkich chorób wynikających ze szczepów zwierzęcych. W ten sposób w ostatnich latach pojawiły się dwie epidemie koronawirusa rozprzestrzeniające się w kilku krajach: zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS) w 2003 r.; i bliskowschodni zespół oddechowy (MERS) w 2012 r. W styczniu 2020 roku opisano kolejną epidemię koronawirusa: epidemię COVID-19, związaną z SARS-CoV-2.

   Choroba określana jako choroba koronawirusowa 2019 (COVID-19) została wykryta po raz pierwszy w Chinach w grudniu 2019 r.; klaster pierwszego przypadku był silnie powiązany z rynkiem żywych zwierząt, co sugerowało pochodzenie zwierzęce; poniższe opisy wyraźnie wykazały transmisję z człowieka na człowieka, z liczbą reprodukcji (R0) między 2,5 a 3,5. Niektóre publikacje naukowe opisywały potencjalne zakażenia osób bezobjawowych. Podczas gdy Chinom udało się w końcu odnotować duży spadek dziennej liczby zachorowań (82 241 ogółem przypadków i 3309 zgonów na dzień 31 marca 2020 r.), epidemia szybko dotarła do wielu innych krajów. We Francji kilka miejsc aktywnego krążenia wirusa (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) ostatecznie doprowadziło do istotnego rozwoju epidemii we Francji (44 450 przypadków i 3024 zgonów na dzień 31 marca 2020 r.).

   Choroba polega na zapaleniu płuc przypominającym w kilku aspektach zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS); po 5 dniach mediany czasu inkubacji objawy rozwijają się wraz z kaszlem, który może być gorączkowy/gorączkowy i który może ewoluować/rozwijać się w kierunku duszności, aw niektórych przypadkach w kierunku ARDS po 7 do 10 dniach ewolucji. Jeśli pierwsze opisy epidemiologiczne wskazywały na wysoki odsetek ciężkich przypadków (ponad 33%), badanie obejmujące ponad 70 000 przypadków sugerowało następnie, że 15% przypadków było ciężkich / wyraźnych, a 5% krytycznych; jednak według nowych badań jest prawdopodobne, że bezobjawowe lub mało objawowe przypadki mogą być liczne. Do tej pory żadne lecznicze leczenie przeciwwirusowe nie wykazało skuteczności klinicznej, ale wiele badań klinicznych jest w toku. Choroba ta stanowi problem dla systemu opieki zdrowotnej z dwóch powodów: zaraźliwości (która wymaga znacznych środków dystansu społecznego) i zachorowalności (która paraliżuje system opieki zdrowotnej, wymagając zbyt dużej hospitalizacji na OIT).

2. ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNE W COVID-19 STAN SZTUKI:

   Głównym celem tego badania jest zatem zbadanie odpowiedzi przeciwciał w zakażeniu SARS-CoV-2 oraz dokładne zidentyfikowanie, a następnie wytworzenie neutralizujących przeciwciał monoklonalnych do zastosowania terapeutycznego i szczepionkowego.

   U pacjentów zakażonych SARS odpowiedź przeciwciał pojawia się zwykle wcześnie, w ciągu dwóch tygodni od wystąpienia pierwszych objawów i utrzymuje się przez co najmniej 16 miesięcy od początku choroby. Reakcje neutralizujące pojawiają się również wcześnie, ale mają tendencję do szybkiego zanikania po 16 miesiącach. Co ciekawe, wykazano, że przeciwciała skierowane przeciwko SARS-CoV są w stanie zneutralizować SARS-CoV-2, co sugeruje istnienie przeciwciał neutralizujących (3). Można to wytłumaczyć stosunkowo wysokim zachowaniem między dwoma wirusami otaczającymi glikoproteiny (około 77% homologii sekwencji, bardzo podobna struktura i wykorzystanie tego samego receptora komórkowego ACE2), które są celem przeciwciał neutralizujących. Podczas infekcji MERS-CoV wykazano również, że odpowiedzi przeciwciał pojawiają się w drugim tygodniu infekcji i utrzymują się przez co najmniej 18 miesięcy. Opisano neutralizującą odpowiedź anty-MERS-CoV: miano wirusa u pacjentów jest odwrotnie proporcjonalne do neutralizujących poziomów Ab. Same przeciwciała neutralizujące nie wystarczają do usunięcia infekcji (4). Co ciekawe, ochronna odpowiedź przeciwciał przeciwko innym koronawirusom, takim jak OC43 i 229E, wydaje się znacznie bardziej ograniczona w czasie (5).

   Charakterystyka odpowiedzi przeciwciał podczas COVID-19, zwłaszcza aktywności neutralizującej, jest ważna dla postępu, jaki umożliwi:

   • Aby zrozumieć charakter i czas trwania potencjalnie ochronnej odpowiedzi humoralnej podczas i po zakażeniu SARS-CoV-2
   • Zbadanie ewolucji odpowiedzi przeciwciał IgM i IgG przeciwko glikoproteinom powierzchniowym SARS-CoV-2, zwłaszcza białku wypustek (SARS2-S)
   • Aby zbadać ewolucję reakcji przeciwciał neutralizujących. Istotne jest, aby lepiej zrozumieć, w jakim stopniu silna odporność humoralna jest generowana u wszystkich zakażonych pacjentów, jeśli ta odpowiedź różni się w zależności od ciężkości i czasu trwania infekcji.
   • Aby przeszukiwać surowice pacjentów w poszukiwaniu osób wykazujących wysokie miana neutralizacji i być może przeciwciał neutralizujących przeciwko różnym koronawirusom. Konieczne jest zrozumienie, czy niektórzy pacjenci mogą wytwarzać przeciwciała neutralizujące, zdolne do neutralizacji różnych koronawirusów.
   • Zbadanie istnienia potencjalnego ułatwienia infekcji wirusowej przez przeciwciała. Rzeczywiście, wzrost zakaźności, w którym pośredniczą przeciwciała, został opisany dla innych koronawirusów i może stanowić wyzwanie dla opracowania szczepionki (6).

   Po tej charakteryzacji badacze będą mogli wyizolować ludzkie przeciwciała monoklonalne od wybranych pacjentów. Izolacja przeciwciał mogłaby w szczególności umożliwić w przyszłości podejście terapeutyczne i szczepionkowe, aby leczyć i zapobiegać nie tylko COVID-19, ale także innym już istniejącym zakażeniom koronawirusem lub w przypadku wybuchu nowego koronawirusa.

   W ten sposób zostaną wybrane i zoptymalizowane najbardziej obiecujące przeciwciała monoklonalne (wysokie powinowactwo, wysoka zdolność neutralizacji) do przyszłego rozwoju jako czynnika terapeutycznego (związki ołowiu).

   Podsumowując, badacze będą mogli wykorzystywać wyizolowane przeciwciała monoklonalne jako narzędzia w podejściach strukturalnych do określania epitopów neutralizujących i opracowywania podejść do szczepionek (odwrotna wakcynologia).

   W celu wyizolowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych u osobników wybranych ze względu na ich odpowiedź humoralną będącą przedmiotem zainteresowania, specyficzne IgG-dodatnie komórki B pamięci niosące przeciwciała przeciwko wybranym celom na ich powierzchni sortuje się za pomocą cytometrii przepływowej. W ramach tego projektu sortowane będą limfocyty B wytwarzające przeciwciała rozpoznające biotynylowane rekombinowane białka SARS-2-S skoniugowane ze streptawidyną znakowaną fluorochromem. Białka te są wytwarzane przez transfekcję komórek 293F, a następnie są oczyszczane. Alternatywna strategia polega na aktywacji limfocytów B i skriningu supernatantów pod kątem obecności specyficznych przeciwciał neutralizujących w testach mikroneutralizacji obejmujących na przykład użycie wirusów pseudotypowanych za pomocą SARS-2-S. Po zidentyfikowaniu specyficznych limfocytów B geny immunoglobulin będące przedmiotem zainteresowania zostaną zamplifikowane metodą PCR z komórek klonalnych w celu identyfikacji łańcuchów ciężkich i lekkich (lambda lub kappa), zgodnie z metodami stosowanymi wcześniej do izolacji przeciwciał przeciwko HIV (7- 10).

   Amplifikowane łańcuchy ciężkie i lekkie są następnie klonowane w wektorze ekspresyjnym przez rekombinację homologiczną. Odpowiednie przeciwciała są wytwarzane przez transfekcję komórek 293F odpowiednią kombinacją łańcuchów ciężkich i lekkich. Po oczyszczeniu i przetestowaniu reaktywności przeciwko białku SARS-2-S ocenimy funkcję neutralizującą, aby zidentyfikować i nadać priorytet kandydatom do głębszej charakterystyki w celu zidentyfikowania związków wiodących.

3. BIOMARKERY:

   Ponadto badacze zamierzają zbadać inne czynniki odpornościowe, komórki odpornościowe, dopełniacz i cytokiny, w celu zidentyfikowania predykcyjnych biomarkerów złego rokowania. Te analizy laboratoryjne mogą być w stanie przewidzieć złe rokowania i przyczynić się do dostosowania opieki medycznej.

   Badania obejmą m.in.

   • Subpopulacja limfocytów T, B i NK oraz subpopulacja monocytów HLA-DR badana metodą cytometrii przepływowej.
   • badanie układu dopełniacza (C3, C4, CH50 i CH50a).
   • badanie cytokin, a zwłaszcza pomiar IL-6 i IL-10 w dniach 1, 3 i 7 hospitalizacji pacjenta.

4. HIPOTEZA BADAWCZA I OCZEKIWANE WYNIKI Badacze będą w stanie monitorować odpowiedzi przeciwciał ukierunkowane na glikoproteiny otoczki SARS-CoV-2 i identyfikować osoby wykazujące odpowiedź immunologiczną z wysokim mianem przeciwciał neutralizujących skierowanych przeciwko SARS-CoV-2. Umożliwi to izolację przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B pamięci pacjentów do celów terapeutycznych i szczepionek.

   Ponadto badanie odporności u pacjentów z COVID-19 umożliwi identyfikację ciężkości i pogarszających się biomarkerów.

5. PROWADZENIE BADAŃ

Wyboru dokonuje się na podstawie dokumentacji medycznej każdego pacjenta:

• który miał pozytywny wynik diagnostyczny COVID-19 RT-PCR
• hospitalizowanych krócej niż 48h w CHUGA i u których występują objawy wynikające z zakażenia.

Po nim następuje wizyta inkluzyjna, podczas której lekarz prowadzący bada klinicznie pacjenta.

Lekarz ten sprawdza kryteria włączenia i niewłączenia, udostępnia badanie pacjentowi i zbiera od pacjenta sprzeciw oraz zgodę na pobranie próbki (Załącznik 2). Po nim następują testy biologiczne związane z opieką, badaniami i gromadzeniem danych (patrz §7.3)

Wizyty kontrolne (wizyty od 2 do 8 od dnia 3 do dnia 30) odbywają się zgodnie z kalendarzem badania w ciągu miesiąca następującego po włączeniu. Lekarz prowadzący bada klinicznie pacjenta, następnie pielęgniarka pobiera krew związaną z opieką i badaniami (biomarkery w dniu 1, 3 i 7 oraz pobranie materiału biologicznego w dniu 1, 3, 7, 13, ostatni dzień hospitalizacji) oraz asystent badań klinicznych zajmuje się zbieraniem danych. Próbki krwi (surowica i jednojądrzaste komórki krwi obwodowej z dnia 1, 13, ostatniego dnia hospitalizacji) są próbkami niezbędnymi do spełnienia podstawowych kryteriów tego badania.

Wizyty następujące po 7. dobie (wizyty od 5. do 8.) odbywają się tylko wtedy, gdy pacjent jest nadal hospitalizowany. Innymi słowy, koniec pobytu w szpitalu oznacza koniec badania dla grupy A.

Dla pacjentów z grupy b może odbyć się wizyta fakultatywna. Dzieje się tak od 2 do 6 miesięcy po włączeniu, gdy pacjent jest regularnie obserwowany w CHUGA i kiedy wyznaczona jest wizyta z pobraniem krwi, która umożliwiłaby pobranie próbek przydatnych do badań.