对 COVID-19 的免疫反应；用于治疗和疫苗的中和抗体的分离。 (AcNT-COVID19)

RELIRE 帕斯卡 POIGNARD

1. 有关病理学的最新知识

   冠状病毒是一个大家族，其成员都具有上皮细胞的嗜性。 它们通常是人类普通和频繁感染的原因，伴有急性和有限的呼吸道炎症。 它们是 RNA 病毒（这赋予它们重要的可塑性），并且某些类型感染动物而其他类型感染人类的​​事实说明它们可能是动物品系引起的新人类疾病的来源。 这就是过去几年在几个国家爆发的两次冠状病毒爆发的方式：2003 年的严重急性呼吸系统综合症 (SARS)；和 2012 年的中东呼吸综合症 (MERS)。 2020 年 1 月，描述了另一场冠状病毒爆发：与 SARS-CoV-2 相关的 COVID-19 爆发。

   2019 年 12 月在中国首次发现了被称为 2019 年冠状病毒病（COVID-19）的疾病；第一个病例群与活体动物市场密切相关，表明动物来源；以下描述确实明确建立了人传人传播，其传播数 (R0) 在 2.5 和 3.5 之间。 一些科学出版物描述了无症状受试者的潜在污染。 尽管中国最终设法大幅减少了每日病例数（2020 年 3 月 31 日总病例数为 82,241 例，死亡 3,309 例），但该流行病迅速蔓延到许多其他国家。 在法国，几个活跃的病毒传播地点（l'Oise、Mulhouse、la Haute-Savoie）最终导致了法国疫情的重要发展（2020 年 3 月 31 日有 44,450 例病例和 3,024 例死亡）。

   这种疾病包括肺炎，在几个方面让人想起急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)；经过 5 天的中位潜伏期后，出现咳嗽症状，可能是发热/发热，并可能演变/发展为呼吸困难，在某些情况下，经过 7 至 10 天演变为 ARDS。 如果最初的流行病学描述表明重症病例比例很高（超过 33%），那么一项包含 70,000 多例病例的研究表明 15% 的病例是重症/显着病例，5% 是危重病例；然而，根据新的研究，无症状或几乎没有症状的病例可能很多。 迄今为止，尚无治愈性抗病毒治疗显示出临床疗效，但许多临床试验正在进行中。 这种疾病对医疗保健系统来说是一个问题，原因有二：它的传染性（需要采取重大的社会疏远措施）和它的发病率（需要过多的 ICU 住院治疗而使医疗保健系统瘫痪）。

2. COVID-19 最新的免疫反应：

   因此，本研究的主要目的是探索 SARS-CoV-2 感染中的抗体反应，并精细鉴定然后产生中和单克隆抗体，用于治疗和疫苗用途。

   在 SARS 感染的患者中，抗体反应通常出现得较早，在出现第一个症状后的两周内，并在疾病开始后持续至少 16 个月。 中和反应也出现得很早，但往往会在 16 个月后迅速减弱。 有趣的是，已经表明针对 SARS-CoV 的抗体能够中和 SARS-CoV-2，这表明存在中和抗体 (3)。 这可以解释为两种病毒包膜糖蛋白之间相对较高的保守性（约 77% 的序列同源性、非常相似的结构和使用相同的细胞受体 ACE2），它们是中和抗体的靶标。 在 MERS-CoV 感染期间，还表明抗体反应出现在感染的第二周，并持续至少 18 个月。 已经描述了抗 MERS-CoV 的中和反应：患者的病毒载量与中和抗体水平成反比。 仅那些中和抗体不足以清除感染 (4)。 有趣的是，针对 OC43 和 229E 等其他冠状病毒的保护性抗体反应似乎在时间上更为有限 (5)。

   COVID-19 期间抗体反应的特征，尤其是中和活性，对于它将允许的进展很重要：

   • 了解 SARS-CoV-2 感染期间和感染后潜在保护性体液反应的性质和持续时间
   • 研究针对 SARS-CoV-2 表面糖蛋白，尤其是刺突蛋白 (SARS2-S) 的 IgM 和 IgG 抗体反应的演变
   • 研究中和抗体反应的演变。 事实上，如果这种反应根据感染的严重程度和持续时间而变化，则必须更好地了解所有感染患者在何种程度上产生强烈的体液免疫。
   • 筛选患者的血清，寻找表现出高中和效价的个体，并可能寻找针对不同冠状病毒的中和抗体。 必须了解某些患者是否可以产生中和抗体，从而中和不同的冠状病毒。
   • 研究抗体是否存在潜在的病毒感染促进作用。 实际上，已经针对其他冠状病毒描述了抗体介导的传染性增加，疫苗开发可能更具挑战性 (6)。

   根据这一特征，研究人员将能够从选定的患者中分离出人类单克隆抗体。 抗体分离可以在未来显着地启用治疗和疫苗方法，不仅可以治疗和预防 COVID-19，还可以治疗和预防其他已经存在的冠状病毒感染，或者在新的冠状病毒爆发的情况下。

   因此，将选择和优化最有前途的单克隆抗体（高亲和力、高中和能力）作为治疗剂（先导化合物）的未来发展。

   总之，研究人员将能够使用分离的单克隆抗体作为结构方法中的工具来确定中和表位和开发疫苗方法（反向疫苗学）。

   为了在根据感兴趣的体液反应而选择的个体中分离人单克隆抗体，通过流式细胞术对表面带有针对所选靶标的抗体的特异性 IgG 阳性记忆 B 细胞进行分类。 作为该项目的一部分，将对产生抗体的 B 细胞进行分类，这些抗体可识别与荧光染料标记的链霉亲和素结合的 SARS-2-S 生物素化重组蛋白。 这些蛋白质是通过转染 293F 细胞产生的，然后进行纯化。 另一种策略包括激活 B 细胞并在微量中和分析中筛选上清液中是否存在特异性中和抗体，例如使用 SARS-2-S 假型病毒。 在鉴定出特定的 B 细胞后，感兴趣的免疫球蛋白基因将通过 PCR 从克隆细胞中扩增，以鉴定重链和轻链（λ 或 kappa），根据先前用于分离抗 HIV 抗体的方法（7- 10).

   随后通过同源重组将扩增的重链和轻链克隆到表达载体中。 相应的抗体是通过重链和轻链的适当组合转染 293F 细胞产生的。 在对 SARS-2-S 蛋白进行纯化和反应性测试后，我们将评估中和功能，以确定候选物并确定其优先级，以进行更深入的表征，以确定先导化合物。

3. 生物标志物：

   此外，研究人员旨在探索其他免疫参与者、免疫细胞、补体和细胞因子，以识别预后不良的预测生物标志物。 这些实验室分析能够预测不良预后，并有助于调整医疗保健。

   调查将包括：

   • 通过流式细胞术研究的 T、B 和 NK 淋巴细胞亚群和单核细胞 HLA-DR 亚群。
   • 补体系统（C3、C4、CH50 和 CH50a）的研究。
   • 细胞因子研究，特别是在患者住院第 1、3 和 7 天测量 IL-6 和 IL-10。

4. 研究假设和预期结果 研究人员将能够监测针对 SARS-CoV-2 包膜糖蛋白的抗体反应，并确定显示出针对 SARS-CoV-2 的高滴度中和抗体免疫反应的受试者。 这将允许从患者的记忆 B 淋巴细胞中分离出用于治疗和疫苗目的的单克隆抗体。

   此外，对 COVID-19 患者的免疫力调查将能够识别严重性和恶化的生物标志物。

5. 研究行为

选择是根据每位患者的医疗记录实现的：

• 谁的 COVID-19 RT-PCR 诊断结果呈阳性
• 在 CHUGA 住院不到 48 小时，并且出现因感染引起的症状。

随后是纳入访问，在此期间，调查医生对患者进行临床检查。

该医生检查纳入和非纳入标准，向患者公开试验并收集患者不反对和抽样同意书（附录 2）。 接下来是与护理、研究和数据收集相关的生物学测试（见§7.3）

后续访问（从第 3 天到第 30 天的第 2 到 8 次访问）按照研究日历中的规定在纳入后的一个月内进行。 一名调查医生对患者进行临床检查，一名护士随后进行与护理和研究相关的血液采样（第 1、3 和 7 天的生物标志物以及第 1、3、7、13 天、最后住院日的生物采集）和一名临床研究助理做数据收集。 血液样本（第 1 天、第 13 天、最后住院日的血清和外周血单核细胞）是本研究主要标准所必需的样本。

第 7 天之后的访问（访问 5 至 8）仅在患者仍在住院的情况下进行。 换言之，住院结束即为 A 组研究的结束。

b 组患者可以进行选择性访视。 它发生在入组后 2 到 6 个月，此时患者在 CHUGA 接受定期随访，并且安排了血液采样访问，这将能够收集对研究有用的样本。