Immunreaktioner på COVID-19; Isolering af neutraliserende antistoffer til terapi og vaccine. (AcNT-COVID19)

EN RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. AKTUEL VIDEN OM PATOLIEN

   Coronavirus er en stor familie, hvis medlemmer deler en tropisme for epitel. De er normalt ansvarlige for almindelige og hyppige infektioner hos mennesker med akut og begrænset betændelse i luftvejene. Det faktum, at de er RNA-vira (hvilket giver dem en vigtig plasticitet), og at nogle typer inficerer dyr og andre inficerer mennesker, forklarer, at de kan være en kilde til nye menneskelige sygdomme, der stammer fra dyrestammer. Sådan opstod to Coronavirus-udbrud, der spredte sig i flere lande i de seneste år: The Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), i 2003; og Middle East Respiratory Syndrome (MERS) i 2012. I januar 2020 er endnu et coronavirus-udbrud blevet beskrevet: COVID-19-udbruddet, relateret til SARS-CoV-2.

   Sygdommen nævnt som coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er blevet opdaget for første gang i Kina i december 2019; en første case-klynge var stærkt relateret til et marked for levende dyr, hvilket tyder på en animalsk oprindelse; de følgende beskrivelser etablerede klart en menneske-til-menneske-transmission med et reproduktionsnummer (R0) mellem 2,5 og 3,5. Nogle videnskabelige publikationer beskrev potentielle kontamineringer fra asymptomatiske forsøgspersoner. Mens Kina endelig formåede at registrere et stort fald i antallet af daglige tilfælde (82.241 samlede tilfælde med 3.309 dødsfald den 31. marts 2020), nåede epidemien hurtigt mange andre lande. I Frankrig førte adskillige steder med aktiv viruscirkulation (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) endelig til en vigtig udvikling af epidemien i Frankrig (44.450 tilfælde med 3.024 dødsfald den 31. marts 2020).

   Sygdommen består i en lungebetændelse, der minder om Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) i flere aspekter; efter 5 dages median inkubationstid udvikles symptomer med hoste, som kan være febril/feberagtig, og som kan udvikle sig/udvikle sig mod dyspnø og i nogle tilfælde mod ARDS efter 7 til 10 dages udvikling. Hvis de første epidemiologiske beskrivelser angav en høj andel af alvorlige tilfælde (mere end 33%), antydede en undersøgelse, der omfattede mere end 70.000 tilfælde, at 15% tilfælde var alvorlige/markerede og 5% kritiske; det er dog sandsynligt, at asymptomatiske eller små symptomatiske tilfælde kan være talrige, ifølge nye undersøgelser. Til dato har ingen helbredende antiviral behandling vist klinisk effekt, men mange kliniske forsøg er i gang. Denne sygdom er et problem for sundhedssystemet af to årsager: dens smitsomhed (som kræver store sociale distanceforanstaltninger) og dens sygelighed (som lammer sundhedssystemet ved at kræve for meget intensiv indlæggelse).

2. IMMUNE RESPONS I COVID-19 STATE OF ART:

   Hovedformålet med denne undersøgelse er derfor at udforske antistofresponserne i SARS-CoV-2-infektion og i fin identifikation og derefter producere neutraliserende monoklonale antistoffer til terapeutisk brug og vaccinebrug.

   Hos SARS-inficerede patienter optræder antistofreaktioner sædvanligvis tidligt, i de to uger efter de første symptomer og varer i mindst 16 måneder efter sygdommens begyndelse. Neutraliserende reaktioner vises også tidligt, men har en tendens til at aftage hurtigt efter 16 måneder. Interessant nok er det blevet vist, at antistoffer rettet mod SARS-CoV er i stand til at neutralisere SARS-CoV-2, hvilket tyder på eksistensen af ​​neutraliserende antistoffer (3). Dette kan forklares med den relativt høje konservering mellem de to vira omslutter glycoproteiner (ca. 77% af sekvenshomologien, en meget lignende struktur og brugen af ​​den samme cellulære receptor ACE2), som er målene for neutraliserende antistoffer. Under MERS-CoV-infektion er det også blevet vist, at antistofreaktioner opstår i den anden infektionsuge og varer i mindst 18 måneder. Et neutraliserende respons anti-MERS-CoV er blevet beskrevet: den virale belastning af patienter er omvendt proportional med de neutraliserende Ab-niveauer. Disse neutraliserende antistoffer alene er ikke tilstrækkelige til infektionsclearance (4). Interessant nok virker det beskyttende antistofrespons mod andre coronavirus som OC43 og 229E meget mere tidsbegrænset (5).

   En karakterisering af antistofresponset under COVID-19, især den neutraliserende aktivitet, er vigtig for de fremskridt, det vil tillade:

   • At forstå arten og varigheden af ​​det potentielt beskyttende humorale respons under og efter infektionen med SARS-CoV-2
   • At studere udviklingen af ​​IgM- og IgG-antistofresponser mod SARS-CoV-2-overfladeglykoproteiner, især spikeproteinet (SARS2-S)
   • At studere neutraliserende antistofresponsudvikling. Det er faktisk væsentligt at forstå bedre, i hvilket omfang en stærk humoral immunitet genereres hos alle inficerede patienter, hvis dette respons varierer i overensstemmelse med infektionens sværhedsgrad og varighed.
   • At screene patienters sera på udkig efter individer, der viser høje neutraliseringstitre og måske for neutraliserende antistoffer mod forskellige coronavirus. Det er vigtigt at forstå, om nogle patienter kan producere neutraliserende antistoffer, der er i stand til at neutralisere forskellige coronavirus.
   • At studere eksistensen af ​​en potentiel virusinfektionsfacilitering af antistoffer. Faktisk er stigningen i infektivitet medieret af antistoffer blevet beskrevet for andre coronavirus og kunne vaccineudviklingen være mere udfordrende (6).

   Efter denne karakterisering vil efterforskerne være i stand til at isolere humane monoklonale antistoffer fra udvalgte patienter. Antistofisolering kunne især muliggøre terapeutiske og vaccinetilgange i fremtiden for at behandle og forebygge ikke kun COVID-19, men også andre allerede eksisterende coronavirusinfektioner eller i tilfælde af et nyt coronavirusudbrud.

   Således vil de mest lovende monoklonale antistoffer (høj affinitet, høj neutraliserende kapacitet) blive udvalgt og optimeret til en fremtidig udvikling som terapeutisk middel (blyforbindelser).

   I fine, vil efterforskerne være i stand til at bruge isolerede monoklonale antistoffer som værktøjer i strukturelle tilgange til bestemmelse af neutraliseringsepitoper og udvikling af vaccinetilgange (omvendt vaccinologi).

   For at isolere humane monoklonale antistoffer i individer udvalgt for deres humorale respons af interesse, sorteres de specifikke IgG positive hukommelse B-celler, der bærer antistoffer mod de udvalgte mål på deres overflade, ved flowcytometri. Som en del af dette projekt vil B-celler, der producerer antistoffer, der genkender SARS-2-S biotinylerede rekombinante proteiner konjugeret til fluorochrom-mærket streptavidin, blive sorteret. Disse proteiner produceres ved transfektion af 293F-celler og oprenses derefter. En alternativ strategi består i at aktivere B-celler og screene supernatanter for tilstedeværelsen af ​​specifikke neutraliserende antistoffer i mikroneutraliseringsassays, der for eksempel involverer anvendelse af vira pseudotype med SARS-2-S. Efter identifikation af de specifikke B-celler vil immunoglobulingenerne af interesse blive amplificeret ved PCR fra klonalcelle for at identificere de tunge og lette (lambda eller kappa) kæder, i overensstemmelse med metoder, der tidligere er brugt til isolering af antistoffer mod HIV (7- 10).

   Amplificerede tunge og lette kæder klones efterfølgende i ekspressionsvektor ved homolog rekombination. De tilsvarende antistoffer produceres ved 293F-celletransfektion med den passende kombination af tunge og lette kæder. Efter oprensning og reaktivitetstest mod SARS-2-S-protein vil vi evaluere neutraliserende funktion for at identificere og prioritere kandidaterne til en dybere karakterisering for at identificere ledende forbindelser.

3. BIOMARKØRER:

   Derudover sigter efterforskerne på at udforske de andre immunitetsspillere, immunceller, komplement og cytokiner, med det formål at identificere prædiktive biomarkører for en dårlig prognose. Disse laboratorieanalyser kunne være i stand til at forudsige dårlig prognose og kunne bidrage til at tilpasse lægebehandlingen.

   Undersøgelserne vil omfatte:

   • T-, B- og NK-lymfocytunderpopulation og monocyt-HLA-DR-subpopulation undersøgt ved flowcytometri.
   • studiet af komplementsystemet (C3, C4, CH50 & CH50a).
   • undersøgelsen af ​​cytokiner og især måling af IL-6 og IL-10 på dag 1, 3 og 7 af patientindlæggelse.

4. FORSKNINGSHYPOTESE OG FORVENTEDE RESULTATER Efterforskerne vil være i stand til at overvåge antistofresponser rettet mod SARS-CoV-2's kappeglykoproteiner og identificere forsøgspersoner, der viser et immunrespons med høje titere af neutraliserende antistoffer rettet mod SARS-CoV-2. Dette vil muliggøre isolering af monoklonale antistoffer fra patienters hukommelse B-lymfocytter til terapeutiske formål og vaccineformål.

   Desuden vil immunitetsundersøgelsen hos COVID-19-patienter muliggøre identifikation af sværhedsgrad og forværrede biomarkører.

5. FORSKNINGSUDFØRELSE

Udvælgelsen er opnået ud fra journalen for hver patient:

• som havde et positivt diagnostisk resultat af COVID-19 RT-PCR
• indlagt i mindre end 48 timer på CHUGA, og som har symptomer som følge af infektionen.

Det efterfølges af et inklusionsbesøg, hvor en undersøgende læge undersøger patienten klinisk.

Denne læge kontrollerer inklusions- og ikke-inklusionskriterierne, afslører forsøget for patienten og indsamler patientens non-modstand og prøveudtagningssamtykke (bilag 2). Det efterfølges af de biologiske tests relateret til pleje, forskning og dataindsamling (se §7.3)

Opfølgningsbesøgene (besøg 2 til 8 fra dag 3 til dag 30) sker som fastsat i studiekalenderen over måneden efter inklusion. En undersøgende læge undersøger patienten klinisk, en sygeplejerske tager derefter blodprøver relateret til pleje og forskning (biomarkører på dag 1, 3 og 7 og biologisk indsamling på dag 1, 3, 7, 13, sidste indlæggelsesdag) og en klinisk forskningsassistent laver dataindsamling. Blodprøven (serum og perifere mononukleære blodceller fra dag 1, 13, sidste indlæggelsesdag) er de prøver, der er nødvendige for de primære kriterier for denne undersøgelse.

Besøgene efter dag 7 (besøg 5 til 8) forekommer kun, hvis patienten stadig er indlagt. Med andre ord etablerer afslutningen af ​​indlæggelsesopholdet afslutningen på undersøgelsen for gruppe A.

Et valgfrit besøg kan finde sted for gruppe b patienter. Det sker 2 til 6 måneder efter inklusion, når patienten følges regelmæssigt op på CHUGA, og når der er planlagt et besøg med blodprøvetagning, som ville muliggøre indsamling af nyttige prøver til forskningen.