Réponses immunitaires au COVID-19 ; Isolement des anticorps neutralisants pour la thérapeutique et les vaccins. (AcNT-COVID19)

UN RELIRE PAR PASCAL POIGNARD

1. CONNAISSANCES ACTUELLES SUR LA PATHOLOGIE

   Les coronavirus sont une grande famille dont les membres partagent un tropisme pour les épithéliums. Ils sont le plus souvent responsables d'infections banales et fréquentes chez l'homme, avec inflammation aiguë et limitée des voies respiratoires. Le fait qu'il s'agisse de virus à ARN (ce qui leur confère une importante plasticité), et que certains types infectent les animaux et d'autres infectent l'homme, expliquent qu'ils puissent être une source de nouvelles maladies humaines issues de souches animales. C'est ainsi que deux épidémies de Coronavirus se propageant dans plusieurs pays sont apparues ces dernières années : Le Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SRAS), en 2003 ; et le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) en 2012. En janvier 2020, une autre épidémie de coronavirus a été décrite : l'épidémie de COVID-19, liée au SARS-CoV-2.

   La maladie mentionnée comme maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a été détectée pour la première fois en Chine en décembre 2019 ; un premier groupe de cas était fortement lié à un marché d'animaux vivants, suggérant une origine animale ; les descriptions suivantes ont clairement établi une transmission interhumaine, avec un indice de reproduction (R0) compris entre 2,5 et 3,5. Certaines publications scientifiques ont décrit des contaminations potentielles par des sujets asymptomatiques. Alors que la Chine a finalement réussi à enregistrer une forte baisse du nombre de cas quotidiens (82 241 cas au total avec 3 309 décès au 31 mars 2020), l'épidémie a rapidement gagné de nombreux autres pays. En France, plusieurs sites de circulation active du virus (l'Oise, Mulhouse, la Haute-Savoie) ont finalement conduit à un développement important de l'épidémie en France (44 450 cas avec 3 024 décès au 31 mars 2020).

   La maladie consiste en une pneumonie rappelant le Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë (SDRA) sous plusieurs aspects ; après un temps d'incubation médian de 5 jours, les symptômes se développent avec une toux qui peut être fébrile/fiévreuse, et qui peut évoluer/évoluer vers la dyspnée, et dans certains cas vers le SDRA après 7 à 10 jours d'évolution. Si les premières descriptions épidémiologiques faisaient état d'une forte proportion de cas graves (plus de 33 %), une étude portant sur plus de 70 000 cas suggérait alors que 15 % des cas étaient graves/marqués, et 5 % critiques ; cependant, il est probable que les cas asymptomatiques ou peu symptomatiques puissent être nombreux, selon de nouvelles études. A ce jour, aucun traitement antiviral curatif n'a démontré d'efficacité clinique mais de nombreux essais cliniques sont en cours. Cette maladie pose problème au système de santé pour deux raisons : sa contagiosité (qui nécessite d'importantes mesures de distanciation sociale) et sa morbidité (qui paralyse le système de santé en nécessitant trop d'hospitalisations en réanimation).

2. RÉPONSES IMMUNITAIRES DANS L'ÉTAT DE L'ART DU COVID-19 :

   L'objectif principal de cette étude est donc d'explorer les réponses anticorps dans l'infection par le SRAS-CoV-2 et in fine d'identifier puis de produire des anticorps monoclonaux neutralisants à usage thérapeutique et vaccinal.

   Chez les patients infectés par le SRAS, les réponses anticorps apparaissent généralement tôt, dans les deux semaines suivant les premiers symptômes et durent au moins 16 mois après le début de la maladie. Les réponses neutralisantes apparaissent également tôt, mais ont tendance à s'estomper rapidement après 16 mois. Fait intéressant, il a été démontré que les anticorps ciblant le SARS-CoV sont capables de neutraliser le SARS-CoV-2, suggérant l'existence d'anticorps neutralisants (3). Cela pourrait s'expliquer par la conservation relativement élevée entre les deux virus des glycoprotéines d'enveloppe (environ 77 % d'homologie de séquence, une structure très similaire et l'utilisation du même récepteur cellulaire ACE2), qui sont les cibles d'anticorps neutralisants. Au cours de l'infection par le MERS-CoV, il a également été montré que les réponses anticorps apparaissent au cours de la deuxième semaine d'infection et durent au moins 18 mois. Une réponse neutralisante anti-MERS-CoV a été décrite : la charge virale des patients étant inversement proportionnelle aux taux d'Ac neutralisants. Ces anticorps neutralisants seuls ne suffisent pas à éliminer l'infection (4). Fait intéressant, la réponse protectrice des anticorps contre d'autres coronavirus comme OC43 et 229E semble beaucoup plus limitée dans le temps (5).

   Une caractérisation de la réponse anticorps au cours du COVID-19, notamment de l'activité neutralisante, est importante pour les progrès qu'elle permettra :

   • Comprendre la nature et la durée de la réponse humorale potentiellement protectrice pendant et après l'infection par le SARS-CoV-2
   • Étudier l'évolution des réponses des anticorps IgM et IgG contre les glycoprotéines de surface du SRAS-CoV-2, en particulier la protéine de pointe (SARS2-S)
   • Étudier l'évolution des réponses des anticorps neutralisants. En effet, il est essentiel de mieux comprendre dans quelle mesure une forte immunité humorale est générée chez tous les patients infectés, si cette réponse varie en fonction de la sévérité et de la durée de l'infection.
   • Pour dépister les sérums des patients à la recherche d'individus présentant des titres de neutralisation élevés et peut-être des anticorps neutralisants contre différents coronavirus. Il est essentiel de comprendre si certains patients peuvent produire des anticorps neutralisants, capables de neutraliser différents coronavirus.
   • Etudier l'existence d'une potentielle infection virale facilitée par les anticorps. En effet, l'augmentation de l'infectivité médiée par les anticorps a été décrite pour d'autres coronavirus et pourrait rendre le développement de vaccins plus difficile (6).

   Suite à cette caractérisation, les chercheurs pourront isoler des anticorps monoclonaux humains de patients sélectionnés. L'isolement des anticorps pourrait notamment permettre des approches thérapeutiques et vaccinales à l'avenir, pour traiter et prévenir non seulement le COVID-19, mais également d'autres infections à coronavirus déjà existantes ou en cas de nouvelle épidémie de coronavirus.

   Ainsi, les anticorps monoclonaux les plus prometteurs (haute affinité, haut pouvoir neutralisant) seront sélectionnés et optimisés pour un futur développement en tant qu'agent thérapeutique (composés principaux).

   In fine, les chercheurs pourront utiliser des anticorps monoclonaux isolés comme outils dans des approches structurales pour la détermination d'épitopes de neutralisation et le développement d'approches vaccinales (vaccinologie inverse).

   Afin d'isoler des anticorps monoclonaux humains chez des individus sélectionnés pour leur réponse humorale d'intérêt, les lymphocytes B mémoire positifs IgG spécifiques porteurs d'anticorps contre les cibles sélectionnées à leur surface, sont triés par cytométrie en flux. Dans le cadre de ce projet, les cellules B produisant des anticorps reconnaissant les protéines recombinantes biotinylées du SARS-2-S conjuguées à la streptavidine marquée au fluorochrome seront triées. Ces protéines sont produites par transfection de cellules 293F puis sont purifiées. Une stratégie alternative consiste à activer les lymphocytes B et à cribler les surnageants pour la présence d'anticorps neutralisants spécifiques dans des tests de micro-neutralisation impliquant par exemple l'utilisation de virus pseudotypés SARS-2-S. Après identification des cellules B spécifiques, les gènes d'immunoglobuline d'intérêt seront amplifiés par PCR à partir de cellule clonale afin d'identifier les chaînes lourdes et légères (lambda ou kappa), conformément aux méthodes précédemment utilisées pour l'isolement des anticorps contre le VIH (7- dix).

   Les chaînes lourdes et légères amplifiées sont ensuite clonées dans le vecteur d'expression par recombinaison homologue. Les anticorps correspondants sont produits par transfection de cellules 293F avec la combinaison appropriée de chaînes lourdes et légères. Après purification et tests de réactivité contre la protéine SARS-2-S, nous évaluerons la fonction neutralisante pour identifier et hiérarchiser les candidats pour une caractérisation plus approfondie afin d'identifier les composés principaux.

3. BIOMARQUEURS :

   Par ailleurs, les chercheurs visent à explorer les autres acteurs de l'immunité, cellules immunitaires, complément et cytokines, dans le but d'identifier des biomarqueurs prédictifs d'un mauvais pronostic. Ces analyses de laboratoire pourraient être en mesure de prédire un mauvais pronostic et pourraient contribuer à adapter les soins médicaux.

   Les enquêtes comprendront :

   • Sous-population de lymphocytes T, B et NK et sous-population de monocytes HLA-DR étudiées par cytométrie en flux.
   • l'étude du système du complément (C3, C4, CH50 & CH50a).
   • l'étude des cytokines et notamment la mesure de l'IL-6 et de l'IL-10 aux jours 1, 3 et 7 d'hospitalisation du patient.

4. HYPOTHÈSES DE RECHERCHE ET RÉSULTATS ATTENDUS Les chercheurs pourront surveiller les réponses anticorps ciblant les glycoprotéines d'enveloppe du SRAS-CoV-2 et identifier les sujets présentant une réponse immunitaire avec des titres élevés d'anticorps neutralisants ciblant le SRAS-CoV-2. Cela permettra d'isoler les anticorps monoclonaux des lymphocytes B mémoire des patients à des fins thérapeutiques et vaccinales.

   De plus, l'investigation de l'immunité chez les patients COVID-19 permettra d'identifier la gravité et l'aggravation des biomarqueurs.

5. CONDUITE DE LA RECHERCHE

La sélection se fait sur la base du dossier médical de chaque patient :

• qui ont eu un résultat de diagnostic positif de COVID-19 RT-PCR
• hospitalisé moins de 48h au CHUGA et présentant des symptômes liés à l'infection.

Elle est suivie d'une visite d'inclusion au cours de laquelle un médecin investigateur examine cliniquement le patient.

Ce médecin vérifie les critères d'inclusion et de non inclusion, expose l'essai au patient et recueille le consentement de non opposition et de prélèvement du patient (Annexe 2). Il est suivi des tests biologiques liés aux soins, à la recherche et au recueil des données (voir §7.3)

Les visites de suivi (visites 2 à 8 du jour 3 au jour 30) se déroulent comme prévu dans le calendrier de l'étude au cours du mois suivant l'inclusion. Un médecin investigateur examine cliniquement le patient, une infirmière effectue ensuite les prélèvements sanguins liés aux soins et à la recherche (biomarqueurs à J1, 3 et 7 et prélèvement biologique à J1, 3, 7, 13, dernier jour d'hospitalisation) et un assistant de recherche clinique effectue la collecte de données. Les prélèvements sanguins (sérum et cellules sanguines mononucléaires périphériques du jour 1, 13, dernier jour d'hospitalisation) sont les prélèvements nécessaires aux critères primaires de cette étude.

Les visites postérieures au jour 7 (visites 5 à 8) n'ont lieu que si le patient est toujours hospitalisé. En d'autres termes, la fin du séjour d'hospitalisation vaut fin d'étude pour le groupe A.

Une visite facultative peut avoir lieu pour les patients du groupe b. Elle survient 2 à 6 mois après l'inclusion lorsque le patient est régulièrement suivi au CHUGA et qu'une visite avec prise de sang est prévue qui permettrait de recueillir des échantillons utiles à la recherche.