HCCにおける進行性疾患および予後のマーカーとしての循環腫瘍細胞の役割
再発の種を見つける：進行性疾患および肝細胞癌の予後のマーカーとして循環腫瘍細胞を検出するリキッドバイオプシーの役割
肝細胞癌 (HCC) は、切除を受けた患者の最大 60% で再発します。 循環腫瘍細胞 (CTC) が再発の促進因子であると主張されています。 しかし、外科的設定における予後マーカーとしてのそれらの役割は不明です。 本研究の目的は、末梢血サンプルからの CTC と手術後の再発リスクとの関連を評価することでした。
最初に HCC と診断され、この疾患に対するこれまでの治療歴がなく、他の腫瘍学的病歴がなく、BCLC ステージ 0-A-B の患者が 2 つのセンターに登録されます。 患者は、手術後0-30-90-180-365日目に連続リキッドバイオプシー（すなわち、各時点で15mlの末梢血サンプル）を受けることになる。 末梢血単核細胞の分離後、FACSymphony™ によって CTC が検出され、続いて次のマーカーが同定されます: EpCAM、N-カドヘリン (N-cad)、および CD90。 上皮間葉転換 (EMT) は、EpCAM+/N-cad- 細胞と EpCAM+/N-cad+ 細胞の数の比として推定される指数 (EMT 指数) によって分析されます。 再発状況に応じて患者を分けます。
調査の概要
詳細な説明
リキッドバイオプシーでは、推定される予後に従って患者をより適切に層別化できる可能性があります。 他の腫瘍でも同様です（例： 乳がんなど）、分子特性解析により、腫瘍の発生と進行を導く病理学的経路をより深く理解できるだけでなく、患者の疾患の特異性に合わせた特定の治療を推進することも可能になりました。 リキッドバイオプシーは、特定の細胞集団を特定するためにセルソーターによって調査される単純な静脈血サンプルで構成されているため、非常に簡単かつ安価に実行できます。
肝細胞癌では再発率が高いことが一般的であり、治癒を目的として治療を受けた患者の 70% が再発します。 このような場合、患者は肝硬変などの炎症性肝疾患を基礎疾患としていることが多く、それが発癌因子として再発を引き起こす可能性があります。 肝硬変は、一般に肝細胞がん発症の危険因子としてよく知られています。 このため、臨床現場では、診断された新しい結節が最初に治療された腫瘍の実際の再発とみなされるべきか、それとも変化していない根本的な腫瘍形成促進に関連した新たな発生とみなされるべきかを区別することはほとんど困難です。肝移植後にのみ治癒します。 いくつかの遡及研究は、無病生存期間および全生存期間の観点から、実際の転移症状と比較して新規発生の利点をすでに実証している。 しかし、これら 2 つの状態を区別するための特定の臨床的または形態学的マーカーに到達した人は誰もいません。 再発性結節の性質の特徴付けは、腫瘍の不均一性の遺伝的および分子的評価によってのみ得られています。 それにもかかわらず、今日この特徴付けは、研究の意図と組織学的標本に基づいてのみ可能であり、組織学的標本は、再発と考えられるものを治療するための再手術の最終的な決定後にのみ提供されます。 手術後のHCC再発の治療法については、まだ適応が得られていない。 私たちの仮説は「種子と油」理論に基づいており、この理論は基本的に血流中の循環腫瘍細胞 (CTC) の存在の証拠に基づいています。 これらの細胞は、すでに浸潤性の特徴を発現している進行がんの特徴として、元の腫瘍から広がる可能性があります。 初期段階の腫瘍は、進行した腫瘍ほど血流中に CTC を放出しないか、同じ速度や質で CTC を放出しないというのが我々の意見です。 我々は、進行した腫瘍とは、すでに微小血管浸潤および/または衛星化を起こしている可能性があり、これは進行したすでに全身性の段階の組織学的徴候である可能性があると考えた。 リキッドバイオプシーで CTC が特定された患者は、予後不良と関連している可能性があり、移植の場合であっても、早期再発率および全体的な再発率が増加する原因となります。 さらに、「リホーミング理論」と関連した「種子と油」理論は、生物腫瘍学の観点から、移植現場での再発例、臓器全体の再発例、および相対的な発癌リスク因子を正当化する可能性がある。 、置換で処理されます。 最後に、病態生理学的な観点から、再発性肝内結節 (IM) が循環腫瘍細胞の播種によるものであることを実証し、これらの腫瘍における発癌の理解を深めることを可能にしたいと考えています。
- 主な目的：血液サンプルで測定されたCTCの変動と、手術（切除および移植のいずれか）の前後のHCC患者の全生存期間および無病生存期間との関連を評価すること。
- 第 2 の目的: 血液サンプル中の CTC の陽性同定が、切除患者と移植患者のいずれにおける再発の肝臓内転移パターンと関連しているかどうかを評価すること。
- 第 3 の目的: 手術後の再発と CTC の存在および率との最終的な関係を決定する際の、さまざまな臨床的、生化学的、放射線学的、および組織病理学的変数の役割を評価および監視すること 患者登録は、この研究の外科部門によって評価されます。通常、外科手術前の外来診察中に行われます。 その時点で患者はこの研究の候補者となり、患者が参加を承諾した場合、研究者は書面による同意を取得します。 登録された患者は、身元を保持するために英数字番号によって体系化されます。 CTC が分析される研究室に雇用される研究者は、サンプルの所有者を追跡することができず、臨床データにアクセスすることもできません (ブラインド分析)。
各患者の手術前に、末梢血からのリキッドバイオプシーが収集されます（通常の血液分析と同時に）。 サンプルは、FACSARIA III (BD bioscience) によって CTC の割合とタイプを分析するために使用されます。 手術中に、専門の病理学者によって腫瘍の新鮮なスライスとほぼ健康な肝臓が収集され、最良の臨床診療および国際ガイドラインで規定されている通常の組織学的評価にその切片が使用されます。 残りの切片は、実験室への輸送中、氷上で維持されます。 研究者は、生きた肝細胞の分離と無菌条件下での保存を行います。 その後、肝細胞は FACSARIA III で分析され、さらなる in vitro 実験に使用されます。
リキッドバイオプシーは、術後 30 日目の最初の外来受診時に再度実施され、その後は地域のフォローアッププロトコルに従って、並行して 6 か月ごとに実施されます。 経過観察中に実施されるリキッドバイオプシーは、臨床目的で提供される通常の検査中に術前のものとして管理されます。 フォローアップは 30 か月で終了します。
すべての手術は肝臓外科の経験が豊富な外科医によって行われます。 切除技術は、地域のプロトコール、優れた臨床慣行、および国のガイドラインに従って、外科医の好みに応じて決定されます。 すべての外科医は、肝機能、腫瘍の位置と直径、結節の数のベースライン変数という同じ基準を手術戦略の選択に採用しました。 再ステージング超音波検査（US）は各患者の術中に行われます。 腫瘍を除去した後、この研究に参加する病理学者は腫瘍をサンプリングして、関連する健康な肝組織とともに腫瘍の新鮮凍結切片を取得し、さらなる分析のために保存します。 このサンプルは、国際ガイドラインおよび地域の倫理協定に従って実行される必要があり、組織学的診断を実行するための正しい材料を常に保証する必要があります。 この研究に登録された患者から採取された組織により、最適な組織学的診断に影響を与えることなく研究用のサンプルを採取できない場合、その患者は研究から除外され、サンプル採取は実行されません。
すべての患者について、20 mL の空腹時血液サンプルが滅菌真空チューブに収集されます。 研究への登録以来、患者には他の侵襲的処置が提供されるべきではないため、収集はルーチンの術前血液サンプルまたは計画されたフォローアップ対照と同時に行われます。 血液サンプルは 4°C で保存され、6 時間以内に処理されます。 次に、5 mL を 4℃、3000 rpm で 10 分間遠心分離し、血漿相を収集して 1.5 mL の滅菌チューブに等分し、使用または出荷するまで -80℃ で保管します。 次に、残りの 15 mL から Ficoll 勾配によって末梢血単核細胞 (PBMC) を分離します。 単離後、生きたＰＢＭＣを２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の標準培地中で凍結し、使用するまで液体窒素中で保存する。
すべての患者の肝臓組織サンプルが収集され、腫瘍 (T) 部分が腫瘍周囲 (PT) 部分から分離されます。 結果として、T および PT 組織からヒト肝細胞 (HC)、クッパー細胞 (KC)、肝臓類洞内皮細胞 (LSEC) およびヒト星状細胞 (HSC) が無菌条件下で単離されます。 簡単に説明すると、肝臓組織をペトリ皿に置き、滅菌メスで切断します。 次に、切断した肝臓を50 mLチューブ内でコラゲナーゼP (1 mg/mL)とともに37℃で45分間インキュベートします。 インキュベーション後、20% FBS ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) を加えてコラゲナーゼ P を不活性化し、細胞懸濁液を 50g、4℃で 5 分間遠心分離します。 肝臓非実質細胞 (NPC) を含む上清を新しい 50 mL チューブに収集し、ペレットをリン酸緩衝液 (PBS) で洗浄します。 ＨＣおよびＮＰＣは、標準培地２０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ中で凍結され、使用するまで液体窒素中で保存される。
T および PT のフラグメントは、RNAlater 溶液中で -80°C で保存されます。 CTCを同定するために、PBMCを解凍し、標準培地に再懸濁し、FACSARIA III (BD bioscience)を用いてEpCAM+、CD47+、CD133+を通して選別する。 単一陽性細胞 (EpCAM+、CD47+、および CD133+) および三重陽性細胞 (EpCAM/CD47/CD133+++) の割合が評価され、総 CTC 数が計算されます。 CTC の複製能力と侵入能力がテストされます。 細胞増殖および浸潤アッセイを使用して、CTC 倍加時間 (細胞数が 2 倍になるのに必要な時間)、増殖速度 (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)=) を評価します。時間 t での細胞数、N(0)= 時間 0 での細胞数、t= 時間) および浸潤率。
CTC の特徴付け後、正確な CTC 肝臓由来を評価するために、前述の陽性マーカーを使用して HC および NPC を分析します。
生物学的材料は専門家の民間輸送機によって輸送され、「Università degli Studi del Piemonte Orientale」の研究室に保管されます。
再発パターンは次のように評価されます。 局所再発は、実質温存切除の場合には同じ肝臓セグメントでの再発、または解剖学的切除の場合は最も近いセグメントの外科的生け垣での再発として定義されます。 したがって、再発性結節の数（単一か複数か）、再発の場所（肝臓内か肝臓外、またはその両方）、主要な再発性結節のサイズおよび肝臓セグメントが評価されます。 再発に関するこのすべての評価は、地域の追跡調査プロトコルが提供するように、追跡調査中に CT スキャンまたは MRI スキャンによって行われます。
すべての患者は、血清α-FP、総ビリルビン、GGT、ALP、アルブミン、INR、血球数、電解質数、超音波、造影コンピュータ断層撮影法（CT）または磁気共鳴画像法（MRI）の測定を含むローカルプロトコルを使用して追跡されます。そしてオフィス訪問。 患者は通常、術後最初の年は 3 か月ごと、その後は 6 か月ごとに検査されます。 再発が発生した場合、症例は放射線科医、肝臓科医、外科医、放射線治療医、放射線療法医、腫瘍医が関与する学際的な環境で議論されます。 全生存期間（OS）は、手術から患者の死亡までの時間間隔（月単位）として定義されます。 フォローアップスクリーニングで患者が緩んだ場合、データは検閲されます。 無病生存期間（DFS）は、手術から再発または死亡までの期間（月単位）として定義されます。 再発がない場合、データは最後に利用可能な追跡調査の日付で打ち切られます。 腫瘍特異的生存（TSS）は、手術から腫瘍関連死亡までの月単位の時間間隔として定義されます。
研究の種類
入学 (推定)
連絡先と場所
研究連絡先
- 名前：Simone Famularo
- 電話番号：+39 3296533353
- メール：simone.famularo@gmail.com
研究連絡先のバックアップ
- 名前：Cristina Ciulli
- 電話番号：+39 3896460025
- メール：cri.ciulli@hotmail.it
研究場所
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-
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Milano、イタリア
- 募集
- ASST Grande Ospedale Metropolitano Niguarda
-
コンタクト：
- Andrea Lauterio, MD
-
主任研究者：
- Luciano De Carlis
-
副調査官：
- Andrea Lauterio
-
Novara、イタリア
- 募集
- Universita del piemonte Orientale
-
コンタクト：
- Rosalba Minisini
-
主任研究者：
- Mario Pirisi
-
副調査官：
- Rosalba Minisini
-
副調査官：
- Matteo Nazzareno Barbaglia
-
副調査官：
- Livia Salmi
-
副調査官：
- Venkata Ramana Mallela
-
Rozzano、イタリア
- まだ募集していません
- Humanitas Research Hospital
-
コンタクト：
- Simone Famularo, MD, PhD
- メール：simone.famularo@gmail.com
-
主任研究者：
- Guido Torzilli
-
主任研究者：
- Matteo Donadon
-
主任研究者：
- Simone Famularo
-
-
MB
-
Monza、MB、イタリア、20900
- 募集
- Ospedale San Gerardo
-
コンタクト：
- Fabrizio Romano
-
主任研究者：
- Fabrizio Romano
-
副調査官：
- Cristina Ciulli
-
副調査官：
- Francesca Carissimi
-
副調査官：
- Linda Roccamatisi
-
副調査官：
- Giuseppe Cordaro
-
副調査官：
- Biagio Eugenio Leone
-
-
参加基準
適格基準
就学可能な年齢
健康ボランティアの受け入れ
サンプリング方法
調査対象母集団
説明
包含基準:
- 肝癌の診断が放射線科によって確認され、治癒を目的とした手術（切除またはOLT）が行われた。
- 肝細胞癌の最初の診断と最初の治療。
- BCLC 0 - A - B
- 組織標本における肝癌の組織学的確認。
- 外科手術中に得られる腫瘍の新鮮な凍結切片の入手可能性
除外基準:
- 臨床病歴にある他の腫瘍。
- 自己免疫性肝疾患の存在（例、 硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変など）。
- 治癒目的ではない場合（緩和、最善の支持療法など）、手術で治療される患者。
- 肝臓原発性新生物を組み合わせた病理組織標本 (例: 「エパト結腸管癌」）。
- 以前に他の治療法でHCCの治療を受けた患者
研究計画
研究はどのように設計されていますか？
デザインの詳細
コホートと介入
グループ/コホート |
介入・治療 |
|---|---|
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肝細胞癌で切除された患者
外科的切除、末梢血採取
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HCCに対する肝臓切除
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良性疾患で手術を受けた患者さん
外科的切除、末梢血採取
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この研究は何を測定していますか？
主要な結果の測定
結果測定 |
メジャーの説明 |
時間枠 |
|---|---|---|
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循環腫瘍細胞と無病生存期間の関連性
時間枠：5年
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血液サンプルで測定されたCTCの変動と手術後のHCC患者の無病生存期間との関連を評価する。
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5年
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二次結果の測定
結果測定 |
メジャーの説明 |
時間枠 |
|---|---|---|
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循環腫瘍細胞と全生存期間との関連性
時間枠：5年
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血液サンプルで測定されたCTCの変動と手術後のHCC患者の全生存期間との関連を評価する。
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5年
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協力者と研究者
協力者
捜査官
- 主任研究者：Fabrizio Romano、University of Milano Bicocca
研究記録日
主要日程の研究
研究開始 (実際)
一次修了 (推定)
研究の完了 (推定)
試験登録日
最初に提出
QC基準を満たした最初の提出物
最初の投稿 (実際)
学習記録の更新
投稿された最後の更新 (推定)
QC基準を満たした最後の更新が送信されました
最終確認日
詳しくは
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