Le rôle des cellules tumorales circulantes en tant que marqueurs de la maladie avancée et du pronostic du CHC

La biopsie liquide pourrait permettre une meilleure stratification des patients en fonction de leur pronostic estimé. Ainsi que dans d'autres tumeurs (par ex. cancer du sein), la caractérisation moléculaire permet non seulement de mieux comprendre les voies pathologiques qui conduisent à la tumorigenèse et à la progression, mais également de piloter des traitements spécifiques adaptés à la spécificité de la maladie du patient. La biopsie liquide est très simple et peu coûteuse à réaliser, car elle consiste en un simple échantillon de sang veineux qui sera étudié par un trieur de cellules pour identifier des populations spécifiques de cellules.

Dans le carcinome hépatocellulaire, il est fréquent d'assister à un taux de récidive élevé : les patients traités à visée curative rechutent dans 70 % des cas. Dans ces cas, les patients souffraient souvent d’une maladie inflammatoire hépatique sous-jacente, telle qu’une cirrhose, qui peut être à l’origine de la rechute en tant que facteur oncogénétique. La cirrhose est un facteur de risque bien connu de développement d’un carcinome hépatocellulaire en général. Pour cette raison, dans la pratique clinique, il est presque difficile de distinguer si le nouveau nodule que nous avons diagnostiqué doit être considéré comme une véritable récidive de la première tumeur traitée, ou comme une apparition de novo liée à l'augmentation inchangée de la tumorigenèse sous-jacente, qui peut être effectivement guéri seulement après une transplantation hépatique. Plusieurs études rétrospectives ont déjà démontré l'avantage, en termes de survie sans maladie et de survie globale, d'une survenue de novo par rapport à une présentation métastatique réelle. Cependant, personne n’a atteint de marqueurs cliniques ou morphologiques spécifiques permettant de distinguer ces deux affections. La caractérisation de la nature du nodule récurrent a été obtenue uniquement par évaluation génétique et moléculaire de l'hétérogénéité des tumeurs. Néanmoins, cette caractérisation n'est aujourd'hui possible qu'à visée de recherche, et sur spécimen histologique, qui ne pourra être fourni qu'après une éventuelle décision de réintervention chirurgicale pour traiter la récidive envisagée. Il manque encore des indications sur la façon de traiter la récidive du CHC après une intervention chirurgicale. Notre hypothèse est fondée sur la théorie des « graines et huiles », qui repose essentiellement sur la preuve de la présence de cellules tumorales circulantes (CTC) dans la circulation sanguine. Ces cellules peuvent se propager à partir des tumeurs d'origine, ce qui constitue une caractéristique d'un cancer avancé, qui a déjà développé des caractéristiques invasives. Nous pensons que les tumeurs à un stade précoce ne libèrent pas de CTC dans le sang, ou pas avec la même vitesse ou la même qualité, que les tumeurs avancées. Nous avons considéré comme tumeur avancée celle qui peut déjà présenter une invasion microvasculaire et/ou une satellitose, qui peuvent être les signes histologiques d'un stade avancé et déjà systémique. Les patients présentant des CTC identifiés lors de la biopsie liquide peuvent être associés à un pronostic plus sombre, expliquant un taux accru de récidive précoce et de récidive globale, même en cas de transplantation. Par ailleurs, la théorie de la « graine et de l'huile », associée à la « théorie du rehoming », peut justifier, d'un point de vue bio-oncologique, les cas de récidive en contexte de transplantation, lorsque l'organe entier, et les facteurs de risque oncogénétiques relatifs , est traité par substitution. Enfin, d'un point de vue physiopathologique, nous souhaitons démontrer que les nodules intra-hépatiques (IM) récurrents sont dus à l'ensemencement de cellules tumorales circulantes, permettant une meilleure compréhension de la carcinogenèse de ces tumeurs.

• Objectif principal : évaluer l'association entre la variation des CTC - déterminés dans des échantillons de sang - et la survie globale et la survie sans maladie chez les patients atteints de CHC avant et après la chirurgie (soit résection, soit greffe).
• Objectif secondaire : évaluer si l'identification positive des CTC dans les échantillons de sang est associée au schéma de récidive métastatique intra-hépatique chez les patients réséqués et transplantés.
• Objectif tertiaire : évaluer et surveiller le rôle de différentes variables cliniques, biochimiques, radiologiques et histopathologiques dans la détermination de la récidive après chirurgie et leur éventuelle relation avec la présence et le taux de CTC. Le recrutement des patients sera évalué par les divisions chirurgicales de cette étude, généralement lors de la visite à la clinique externe avant l’opération chirurgicale. À ce moment-là, les patients seront candidats à cette étude et, s'ils acceptent de participer, les chercheurs obtiendront le consentement écrit. Les patients inscrits seront codifiés par un numéro alphanumérique pour préserver l'identité. Les chercheurs qui seront employés dans le laboratoire où les CTC seront analysés ne pourront pas retrouver le propriétaire de l'échantillon et n'auront pas accès aux données cliniques (analyse aveugle).

Avant la chirurgie, pour chaque patient, une biopsie liquide du sang périphérique sera prélevée (en même temps que l'analyse sanguine de routine). Des échantillons seront utilisés pour analyser le taux et le type de CTC par FACSARIA III (BD bioscience). Pendant l'intervention chirurgicale, une nouvelle tranche de la tumeur et un foie en bonne santé seront prélevés par un pathologiste expert, qui utilisera des sections pour l'évaluation histologique habituelle telle que prévue par les meilleures pratiques cliniques et les directives internationales. Les coupes restantes seront maintenues sur la glace lors de leur expédition vers l'unité de laboratoire. Les chercheurs procéderont à l’isolement et au stockage de cellules hépatiques vivantes dans des conditions stériles. Ensuite, les cellules hépatiques seront analysées avec FACSARIA III et utilisées pour d'autres expériences in vitro.

Une biopsie liquide sera à nouveau réalisée au 30ème jour postopératoire lors de la première visite ambulatoire, puis tous les six mois, conformément et en parallèle aux protocoles locaux de suivi. La biopsie liquide réalisée lors du suivi sera gérée comme la biopsie préopératoire, lors des tests normaux prévus à des fins cliniques. Le suivi sera clôturé à 30 mois.

Toutes les opérations seront réalisées par des chirurgiens possédant une grande expérience en chirurgie hépatique. La technique de résection sera au choix du chirurgien, selon le protocole local, les bonnes pratiques cliniques et les directives nationales. Tous les chirurgiens ont adopté les mêmes critères pour sélectionner la stratégie chirurgicale : variables de base de la fonction hépatique, de la localisation et du diamètre de la tumeur, ainsi que du nombre de nodules. Une échographie de restaging (US) sera réalisée en peropératoire pour chaque patient. Après l'ablation de la tumeur, un pathologiste impliqué dans cette étude échantillonnera la tumeur pour obtenir une section fraîchement congelée de la tumeur, avec le tissu hépatique sain associé, pour la stocker pour une analyse plus approfondie. Cet échantillon doit être réalisé conformément aux directives internationales et aux accords éthiques locaux, et doit toujours garantir le matériel correct pour effectuer le diagnostic histologique. Si le tissu prélevé sur le patient inscrit à cette étude ne permet pas de réaliser le prélèvement pour l'étude sans affecter le diagnostic histologique optimal, le patient sera exclu de l'étude et aucun prélèvement ne sera effectué.

Pour tous les patients, 20 ml d'échantillon de sang à jeun seront prélevés dans un tube à vide stérile. La collecte se fera en même temps que des échantillons de sang préopératoires de routine ou des contrôles de suivi planifiés, puisqu'aucune autre procédure invasive ne doit être proposée aux patients depuis leur inscription à l'étude. L'échantillon de sang sera conservé à 4°C et manipulé dans les 6 heures. Ensuite, 5 mL seront centrifugés à 3000 tr/min pendant 10 minutes à 4°C, la phase plasmatique sera collectée et aliquotée dans des tubes stériles de 1,5 mL et conservée à -80°C jusqu'à utilisation ou expédition. Ensuite, nous isolerons les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) via un gradient de Ficoll à partir des 15 ml restants. Après isolement, les PBMC vivantes seront congelées dans un milieu standard à 20 % de sérum bovin fœtal (FBS) à 10 % de dyméthylsulfoxyde (DMSO) et conservées dans de l'azote liquide jusqu'à utilisation.

Pour tous les patients, un échantillon de tissu hépatique sera prélevé et la partie tumorale (T) sera séparée de la partie péritumorale (PT). À partir des tissus T et PT seront isolés en conséquence des hépatocytes humains (HC), des cellules de Kupffer (KC), des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (LSEC) et des cellules étoilées humaines (HSC) dans des conditions stériles. En bref, le tissu hépatique sera placé dans une boîte de Pétri et coupé avec un scalpel stérile. Ensuite, le foie coupé sera incubé dans un tube de 50 mL avec de la collagénase P (1 mg/mL) à 37°C pendant 45 minutes. Après incubation, la collagénase P sera inactivée en ajoutant 20 % de FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS) et la suspension cellulaire sera centrifugée 50 g pendant 5 minutes à 4°C. Le surnageant, contenant des cellules hépatiques non parenchymateuses (NPC), sera collecté dans un nouveau tube de 50 ml et le culot sera lavé avec une solution tampon phosphate (PBS). HC et NPC seront congelés dans un milieu standard 20 % FBS 10 % DMSO et stockés dans de l'azote liquide jusqu'à utilisation.

Un fragment de T et PT sera stocké dans une solution RNAlater à -80°C. Pour l'identification du CTC, les PBMC seront décongelées, remises en suspension dans un milieu standard et triées avec FACSARIA III (BD bioscience) via EpCAM+, CD47+, CD133+. Le pourcentage de cellules simples positives (EpCAM+, CD47+ et CD133+) et de cellules triples positives (EpCAM/CD47/CD133+++) seront évaluées et le nombre total de CTC sera calculé. Les CTC seront testés pour leur capacité réplicative et invasive. En utilisant le test de prolifération cellulaire et d'invasion, nous évaluerons le temps de doublement du CTC (temps nécessaire pour que les cellules doublent en nombre), le taux de croissance (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= le nombre de cellules au temps t, N(0)= le nombre de cellules au temps 0, t= temps) et le taux d'invasion.

Après la caractérisation du CTC, nous analyserons HC et NPC, en utilisant les marqueurs positifs décrits précédemment, afin d'évaluer la dérivation hépatique exacte du CTC.

Le matériel biologique sera expédié par transport privé expert et stocké au laboratoire de "Università degli Studi del Piemonte Orientale".

Les modèles de récidive seront évalués comme suit. La récidive locale sera définie comme une récidive sur le même segment hépatique en cas de résection épargnant le parenchyme, ou sur la haie chirurgicale des segments les plus proches en cas de résection anatomique. Ainsi, il sera évalué le nombre de nodules récurrents (simples versus multiples), la localisation de la récidive (intrahépatique versus extrahépatique ou les deux), la taille du nodule récurrent principal et du segment hépatique. Toutes ces évaluations de récidive seront réalisées par scanner ou IRM lors du suivi, comme le prévoient les protocoles de suivi locaux.

Tous les patients seront suivis à l'aide d'un protocole local comprenant la mesure de l'α-FP sérique, de la bilirubine totale, de la GGT, de l'ALP, de l'albumine, de l'INR, de la formule sanguine, de la numération électrolytique, de l'échographie, de la tomodensitométrie (TDM) de contraste ou de l'imagerie par résonance magnétique (IRM). et visites au bureau. Les patients sont généralement contrôlés tous les 3 mois au cours de la première année postopératoire et tous les 6 mois par la suite. Lorsque la récidive survient, les cas sont discutés dans un cadre multidisciplinaire associant radiologue, hépatologue, chirurgien, radiologue interventionnel, radiothérapeute et oncologue. La survie globale (OS) est définie comme l'intervalle de temps (en mois) entre la chirurgie et le décès du patient. Les données seront censurées en cas de perte du patient lors du dépistage de suivi. La survie sans maladie (DFS) est définie comme l'intervalle de temps (en mois) entre la chirurgie et la récidive ou le décès. En cas de non-récidive, les données seront censurées à la date du dernier suivi disponible. La survie spécifique à la tumeur (TSS) est définie comme l'intervalle de temps en mois entre la chirurgie et le décès lié à la tumeur.