A keringő daganatsejtek szerepe az előrehaladott betegségek és a prognózis markereiként a HCC-ben

A folyékony biopszia lehetővé teheti a betegek jobb rétegződését a becsült prognózisuk szerint. Más daganatoknál is (pl. emlőrák), a molekuláris jellemzés nemcsak a daganatképződéshez és progresszióhoz vezető kóros folyamatok jobb megértését teszi lehetővé, hanem a beteg betegségének sajátosságaira szabott specifikus kezelések előmozdítását is. A folyékony biopszia nagyon könnyen és olcsón kivitelezhető, mivel egy egyszerű vénás vérmintából áll, amelyet sejtválogató vizsgál meg, hogy azonosítsa a sejtpopulációkat.

Hepatocellularis carcinomában gyakori, hogy segítse a megnövekedett kiújulási arányt: a gyógyító szándékkal kezelt betegek az esetek 70%-ában visszaesnek. Ezekben az esetekben a betegek gyakran gyulladásos májbetegségben, például cirrhosisban szenvedtek, amely onkogenetikai tényezőként vezetheti a visszaesést. A májzsugor általában jól ismert kockázati tényező a hepatocelluláris karcinóma kialakulásában. Emiatt a klinikai gyakorlatban szinte nehéz megkülönböztetni, hogy az általunk diagnosztizált új gócot az elsőként kezelt daganat valódi kiújulásának kell-e tekinteni, vagy de-novo előfordulásnak, amely a változatlan mögöttes tumorigenezis-fokozódáshoz köthető, ami hatékony lehet. csak májátültetés után gyógyul meg. Számos retrospektív tanulmány már kimutatta a betegségmentes túlélés és az általános túlélés szempontjából a de-novo előfordulás előnyeit a valódi metasztatikus megjelenéshez képest. Senki azonban nem ért el semmilyen olyan specifikus klinikai vagy morfológiai markert, amely megkülönböztetné ezt a két állapotot. A kiújuló góc természetének jellemzésére csak a daganatok heterogenitásának genetikai és molekuláris értékelése alapján került sor. Ez a jellemzés azonban manapság csak kutatási szándékkal és szövettani mintán lehetséges, amely csak a szóban forgó recidíva kezelésére irányuló műtéti ismételt döntés után adható. Még mindig hiányzik a műtét utáni HCC kiújulásának kezelésére vonatkozó jelzés. Hipotézisünk a "mag és olaj" elméleten alapul, amely alapvetően a keringő tumorsejtek (CTC) véráramban való jelenlétének bizonyítékán alapul. Ezek a sejtek az eredeti daganatokból terjedhetnek az előrehaladott rák jellemzőjeként, amely már kifejlesztette az invazivitás jellemzőit. Véleményünk szerint a korai stádiumban lévő daganatok nem, vagy nem olyan mértékben és minőségben bocsátanak ki CTC-ket a véráramba, mint az előrehaladott daganatok. Előrehaladott daganatnak azt tekintettük, amelynél előfordulhat már mikrovaszkuláris invázió és/vagy satellitosis, ami egy előrehaladott és már szisztémás stádium szövettani jele lehet. A folyékony biopsziával azonosított CTC-s betegek prognózisa rosszabbodhat, ami a korai kiújulás és a teljes kiújulás arányának növekedését eredményezi, még transzplantáció esetén is. Emellett a "rehoming elmélethez" kapcsolódó "mag és olaj" elmélet bio-onkológiai szempontból igazolhatja a transzplantációs körülmények között előforduló recidíva eseteit, amikor az egész szervet, valamint a relatív onkogenetikai kockázati tényezőket. , helyettesítéssel kezeljük. Végül, patofiziológiai szempontból azt szeretnénk bemutatni, hogy a visszatérő intrahepatikus csomók (IM) a keringő tumorsejtek kioltásának köszönhetőek, lehetővé téve a daganatok karcinogenezisének jobb megértését.

• Elsődleges cél: a vérmintákban meghatározott CTC-k variációja és a teljes túlélés és a betegségmentes túlélés közötti összefüggés értékelése HCC-s betegek műtét előtt és után (reszekció és transzplantáció).
• Másodlagos cél: annak értékelése, hogy a CTC-k pozitív azonosítása a vérmintákban összefüggésben áll-e a májon belüli metasztatikus recidíva mintázatával akár reszekált, akár transzplantált betegeknél.
• Harmadlagos cél: a különböző klinikai, biokémiai, radiológiai és kórszövettani változók szerepének értékelése és nyomon követése a műtét utáni recidíva meghatározásában, valamint ezek esetleges kapcsolata a CTC-k jelenlétével és gyakoriságával. A betegek felvételét a vizsgálat sebészeti osztályai fogják értékelni, általában a műtét előtti ambuláns látogatás során. Ebben a pillanatban a betegek jelöltek lesznek ebbe a vizsgálatba, és ha elfogadják a részvételt, a kutatók megszerzik az írásos beleegyezést. A beiratkozott betegeket egy alfanumerikus számmal kódoljuk, hogy megőrizzük az azonosságot. A CTC-k elemzését végző laboratóriumban dolgozó kutatók nem tudják nyomon követni a minta tulajdonosát, és nem férhetnek hozzá a klinikai adatokhoz (vakelemzés).

A műtét előtt minden betegnél folyékony biopsziát vesznek a perifériás vérből (a rutin vérvizsgálattal egy időben). A mintákat a CTC-k arányának és típusának a FACSARIA III (BD bioscience) elemzésére fogja használni. A műtét során a daganat friss szeletét és a közeli májat szakértő patológus gyűjti össze, aki metszet(eke)t használ a szokásos szövettani értékeléshez, a legjobb klinikai gyakorlat és a nemzetközi irányelvek szerint. A fennmaradó részeket jégen tartják a laboratóriumi egységbe történő szállítás során. A kutatók élő májsejtek izolálását és tárolását végzik steril körülmények között. Ezután a májsejteket FACSARIA III-mal elemezzük, és további in vitro kísérletekhez használjuk fel.

A folyékony biopsziát a műtét utáni 30. napon, az első ambuláns vizit alkalmával, majd félévente ismételjük, a helyi követési protokolloknak megfelelően és azzal párhuzamosan. Az utánkövetés során végzett folyékony biopsziát preoperatívként kezeljük, a klinikai célra biztosított normál vizsgálatok során. A nyomon követést 30 hónap elteltével zárják le.

Minden műtétet olyan sebészek végeznek, akik nagy tapasztalattal rendelkeznek a májsebészetben. A reszekciós technikát a sebész preferálja, a helyi protokollnak, a helyes klinikai gyakorlatnak és a nemzeti irányelveknek megfelelően. Minden sebész ugyanazokat a kritériumokat alkalmazta a műtéti stratégia kiválasztásához: a májfunkció alapváltozói, a daganat elhelyezkedése és átmérője, valamint a csomók száma. Restaging Ultrasonography (US) minden betegnél intraoperatív módon történik. A daganat eltávolítása után a vizsgálatban részt vevő patológus mintát vesz a daganatból, hogy a daganat frissen fagyasztott szakaszát a kapcsolódó egészséges májszövettel együtt tárolja további elemzés céljából. Ezt a mintát a nemzetközi irányelveknek és a helyi etikai megállapodásoknak megfelelően kell elvégezni, és mindig garantálnia kell a megfelelő anyagot a szövettani diagnózis elvégzéséhez. Ha a vizsgálatba bevont páciensből eltávolított szövet nem teszi lehetővé a mintavételezést a vizsgálathoz anélkül, hogy ez befolyásolná az optimális szövettani diagnózist, a beteget kizárják a vizsgálatból, és nem történik mintavétel.

Minden betegnél 20 ml éhgyomri vérmintát veszünk egy steril vákuumcsőben. A gyűjtés a rutin preoperatív vérmintákkal vagy a tervezett nyomon követési kontrollokkal egy időben történik, mivel a vizsgálatba való felvételük óta nem szabad más invazív eljárást biztosítani a betegeknek. A vérmintát 4°C-on tárolják és 6 órán belül kezelik. Ezután 5 ml-t centrifugálunk 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig 4 °C-on, a plazmafázist összegyűjtjük és 1,5 ml-es steril csövekbe osztjuk, és -80 °C-on tároljuk felhasználásig vagy szállításig. Ezután a perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) Ficoll-gradiensen keresztül izoláljuk a fennmaradó 15 ml-ből. Az izolálás után az élő PBMC-t standard tápközegben fagyasztják le, amely 20% Fetal Bovin Serum (FBS) és 10% Dymethil Sulfoxide (DMSO) tartalmazza, és felhasználásig folyékony nitrogénben tárolják.

Minden betegnél májszövetmintát vesznek, és a tumor (T) részt elválasztják a peritumor (PT) résztől. A T és PT szövetekből következetesen humán hepatocitákat (HC), Kupffer sejteket (KC), máj szinuszos endotélsejteket (LSEC) és humán csillagsejteket (HSC) izolálunk steril körülmények között. Röviden, a májszövetet Petri-csészébe helyezzük, és steril szikével levágjuk. Ezután a levágott májat 50 ml-es csőben kollagenáz P-vel (1 mg/ml) inkubáljuk 37 °C-on 45 percig. Inkubálás után a kollagenáz P-t 20%-os FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS) hozzáadásával inaktiváljuk, és a sejtszuszpenziót 50 g-vel 5 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A máj nem parenchimális sejteket (NPC) tartalmazó felülúszót egy új, 50 ml-es csőbe gyűjtjük, és a pelletet foszfátpufferoldattal (PBS) mossuk. A HC-t és az NPC-t 20% FBS-t és 10% DMSO-t tartalmazó standard tápközegben lefagyasztják, és felhasználásig folyékony nitrogénben tárolják.

A T és PT egy fragmensét RNAlater oldatban tároljuk -80 °C-on. A CTC azonosításához a PBMC-t felengedjük, standard tápközegben újraszuszpendáljuk, és FACSARIA III-mal (BD bioscience) EpCAM+, CD47+, CD133+ segítségével válogatjuk. Az egyszeres pozitív sejtek (EpCAM+, CD47+ és CD133+) és a hármas pozitív sejtek (EpCAM/CD47/CD133+++) százalékos arányát értékeljük, és kiszámítjuk a teljes CTC-számot. A CTC-ket replikációs és invazív képességükre tesztelik. Sejtproliferációs és inváziós vizsgálattal értékeljük a CTC megduplázódási idejét (a sejtek számának megduplázódásához szükséges idő), a növekedési sebességet (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)=) a sejtek száma a t időpontban, N(0)= a sejtek száma a 0 időpontban, t=idő) és az invázió sebessége.

A CTC jellemzése után a HC-t és az NPC-t elemezzük a korábban leírt pozitív markerek segítségével, hogy kiértékeljük a pontos CTC májszármazékot.

A biológiai anyagot szakértő magánszállítással szállítják és az "Università degli Studi del Piemonte Orientale" laboratóriumba tárolják.

Az ismétlődési mintákat a következőképpen értékeljük. Lokális recidívának tekintjük, ha parenchyma megkímélő reszekció esetén ugyanazon a májszakaszon, anatómiai reszekció esetén a legközelebbi szegmensek műtéti sövényén jelentkezik. Így értékelni kell az ismétlődő csomók számát (egyszeres vagy többszörös), a kiújulás helyét (intrahepatikus versus extrahepatikus vagy mindkettő), a fő visszatérő csomó méretét és a májszegmenst. A kiújulással kapcsolatos értékelések mindegyike CT- vagy MRI-vizsgálattal történik a nyomon követés során, amint azt a helyi nyomon követési protokollok előírják.

Minden beteget helyi protokoll segítségével követnek, beleértve a szérum α-FP, összbilirubin, GGT, ALP, albumin, INR, vérkép, elektrolitszám, ultrahang, kontrasztos számítógépes tomográfia (CT) vagy mágneses rezonancia képalkotás (MRI) mérését. és irodalátogatások. A betegeket általában 3 havonta ellenőrizzük az első posztoperatív évben, majd 6 havonta. Amikor a kiújulás bekövetkezett, az eseteket multidiszciplináris keretek között vitatják meg radiológus, hepatológus, sebész, intervenciós radiológus, sugárterapeuta és onkológus bevonásával. Az általános túlélés (OS) a műtéttől a beteg haláláig terjedő időtartam (hónapokban). Elengedett beteg esetén az utóvizsgálaton az adatokat cenzúrázzuk. A betegségmentes túlélés (DFS) a műtéttől a kiújulásig vagy a halálig terjedő időtartam (hónapokban). Ha nem történik meg ismétlődés, az adatokat az utolsó elérhető nyomon követés időpontjában cenzúrázzuk. A tumorspecifikus túlélés (TSS) a műtét és a tumorral összefüggő halál közötti időszak hónapokban kifejezett időtartama.