Il ruolo delle cellule tumorali circolanti come marcatori di malattia avanzata e prognosi nell'HCC

La biopsia liquida può consentire una migliore stratificazione dei pazienti in base alla prognosi stimata. Anche in altri tumori (es. cancro al seno), la caratterizzazione molecolare sta consentendo non solo di comprendere meglio i percorsi patologici che portano alla genesi e alla progressione del tumore, ma anche di guidare trattamenti specifici adattati alla specificità della malattia del paziente. La biopsia liquida è molto semplice ed economica da eseguire, poiché consiste in un semplice campione di sangue venoso che verrà analizzato da un selezionatore di cellule per identificare specifiche popolazioni di cellule.

Nel carcinoma epatocellulare è comune riscontrare un elevato tasso di recidiva: i pazienti che sono stati trattati con intento curativo, nel 70% dei casi recidivano. In questi casi, i pazienti spesso avevano una malattia infiammatoria epatica sottostante, come la cirrosi, che può portare alla recidiva come fattore oncogenetico. La cirrosi è un noto fattore di rischio per lo sviluppo del carcinoma epatocellulare in generale. Per questo motivo, nella pratica clinica è quasi difficile distinguere se il nuovo nodulo da noi diagnosticato debba essere considerato una reale recidiva del primo tumore trattato, oppure un’insorgenza de novo legata all’immutato boost di tumorigenesi sottostante, che può essere efficacemente guarito solo dopo il trapianto di fegato. Diversi studi retrospettivi hanno già dimostrato il vantaggio, in termini di sopravvivenza libera da malattia e di sopravvivenza globale, di un'insorgenza de-novo rispetto ad una vera e propria presentazione metastatica. Tuttavia, nessuno ha raggiunto alcun marcatore clinico o morfologico specifico per distinguere tra queste due condizioni. La caratterizzazione della natura del nodulo ricorrente è stata ottenuta solo mediante valutazione genetica e molecolare dell'eterogeneità dei tumori. Tuttavia, questa caratterizzazione oggi è possibile solo con intenti di ricerca, e su campioni istologici, che potrebbero essere forniti solo dopo un'eventuale decisione di riintervento per trattare la recidiva considerata. Mancano ancora indicazioni su come trattare la recidiva di HCC dopo l’intervento chirurgico. La nostra ipotesi si fonda sulla teoria "seme e olio", che si fonda fondamentalmente sull'evidenza della presenza di cellule tumorali circolanti (CTC) nel flusso sanguigno. Queste cellule possono diffondersi dai tumori originali come segno distintivo di un cancro avanzato, che ha già sviluppato la caratteristica di invasività. È nostra opinione che i tumori in fase iniziale non rilasciano, o non nella stessa velocità o qualità, le CTC nel flusso sanguigno come fanno i tumori avanzati. Abbiamo considerato tumore avanzato quello che può già presentare invasione microvascolare e/o satellitosi, che possono essere segni istologici di uno stadio avanzato e già sistemico. I pazienti con CTC identificate alla biopsia liquida possono essere associati a una prognosi peggiore, determinando un aumento del tasso di recidiva precoce e di recidiva complessiva, anche in caso di trapianto. Inoltre, la teoria “seme e olio”, associata alla “teoria del rehoming”, può giustificare, dal punto di vista bio-oncologico, i casi di recidiva nel setting del trapianto, quando l’intero organo, ed i relativi fattori di rischio oncogenetici , viene trattato per sostituzione. Infine, da un punto di vista fisiopatologico, vogliamo dimostrare che i noduli intraepatici ricorrenti (IM) sono dovuti alla semina di cellule tumorali circolanti, consentendo una migliore comprensione della carcinogenesi in tali tumori.

• Obiettivo primario: valutare l'associazione tra la variazione delle CTC - determinate nei campioni di sangue - e la sopravvivenza globale e libera da malattia nei pazienti con HCC prima e dopo l'intervento chirurgico (resezione e trapianto).
• Obiettivo secondario: valutare se l'identificazione positiva delle CTC nei campioni di sangue è associata al pattern metastatico intraepatico di recidiva sia nei pazienti resecati che in quelli trapiantati.
• Obiettivo terziario: valutare e monitorare il ruolo di diverse variabili cliniche, biochimiche, radiologiche e istopatologiche nel determinare la recidiva dopo l'intervento chirurgico e la loro eventuale relazione con la presenza e il tasso di CTC. L'arruolamento dei pazienti sarà valutato dalle divisioni chirurgiche di questo studio, solitamente durante la visita ambulatoriale prima dell'intervento chirurgico. In quel momento i pazienti saranno candidati a questo studio e, se accetteranno di partecipare, i ricercatori acquisiranno il consenso scritto. I pazienti iscritti verranno codificati da un numero alfanumerico per preservarne l'identità. I ricercatori che lavoreranno nel laboratorio dove verranno analizzate le CTC non saranno in grado di risalire al proprietario del campione e non avranno accesso ai dati clinici (analisi alla cieca).

Prima dell'intervento chirurgico per ciascun paziente verrà raccolta una biopsia liquida dal sangue periferico (contemporaneamente alle analisi del sangue di routine). I campioni verranno utilizzati per analizzare il tasso e il tipo di CTC mediante FACSARIA III (BD bioscience). Durante l'intervento chirurgico, un patologo esperto raccoglierà una fetta fresca del tumore e del fegato quasi sano, che utilizzerà le sezioni per la consueta valutazione istologica come previsto dalla migliore pratica clinica e dalle linee guida internazionali. Le restanti sezioni verranno mantenute nel ghiaccio durante la spedizione all'unità di laboratorio. I ricercatori effettueranno l'isolamento e la conservazione delle cellule epatiche vive in condizioni sterili. Successivamente, le cellule epatiche verranno analizzate con FACSARIA III e utilizzate per ulteriori esperimenti in vitro.

La biopsia liquida verrà eseguita nuovamente alla 30a giornata postoperatoria durante la prima visita ambulatoriale, e successivamente ogni sei mesi, in conformità e in parallelo con i protocolli locali di follow-up. La biopsia liquida eseguita durante il follow-up verrà gestita come quella pre-operatoria, durante i normali esami previsti a scopo clinico. Il follow-up si chiuderà a 30 mesi.

Tutti gli interventi saranno eseguiti da chirurghi con ampia esperienza nella chirurgia del fegato. La tecnica di resezione sarà scelta dal chirurgo, secondo il protocollo locale, la buona pratica clinica e le linee guida nazionali. Tutti i chirurghi hanno adottato gli stessi criteri per selezionare la strategia chirurgica: variabili basali di funzionalità epatica, localizzazione e diametro del tumore e numero di noduli. L'ecografia di ristadiazione (US) verrà eseguita intraoperatoriamente per ciascun paziente. Dopo la rimozione del tumore, un patologo coinvolto in questo studio preleverà un campione del tumore per ottenere una sezione fresca congelata del tumore, con il relativo tessuto epatico sano, da conservare per ulteriori analisi. Questo campione deve essere eseguito in conformità con le linee guida internazionali e l'accordo etico locale e deve sempre garantire il materiale corretto per eseguire la diagnosi istologica. Se il tessuto rimosso dal paziente arruolato in questo studio non consente di eseguire il prelievo per lo studio senza influenzare la diagnosi istologica ottimale, il paziente verrà escluso dallo studio e non verrà eseguito alcun campionamento.

Per tutti i pazienti verranno raccolti 20 ml di campione di sangue a digiuno in una provetta a vuoto sterile. La raccolta verrà effettuata contemporaneamente ai prelievi di sangue preoperatori di routine o ai controlli di follow-up programmati, poiché nessun'altra procedura invasiva dovrebbe essere fornita ai pazienti dal momento del loro arruolamento nello studio. Il campione di sangue verrà conservato a 4°C e manipolato entro 6 ore. Quindi, 5 mL verranno centrifugati a 3000 giri al minuto per 10 minuti a 4°C, la fase plasmatica verrà raccolta e aliquotata in provette sterili da 1,5 mL e conservata a -80°C fino all'uso o alla spedizione. Quindi, isoleremo le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) attraverso il gradiente Ficoll dai rimanenti 15 mL. Dopo l'isolamento, le PBMC vive verranno congelate in terreni standard 20% siero fetale bovino (FBS) 10% dimetilsolfossido (DMSO) e conservate in azoto liquido fino all'uso.

Per tutti i pazienti verrà raccolto un campione di tessuto epatico e la porzione tumorale (T) verrà separata dalla porzione peritumorale (PT). Dai tessuti T e PT verranno isolati successivamente epatociti umani (HC), cellule di Kupffer (KC), cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSEC) e cellule stellate umane (HSC) in condizioni sterili. In breve, il tessuto epatico verrà posto in una capsula Petri e tagliato con un bisturi sterile. Quindi, il fegato tagliato verrà incubato in una provetta da 50 mL con collagenasi P (1 mg/mL) a 37°C per 45 minuti. Dopo l'incubazione, la collagenasi P verrà inattivata aggiungendo il 20% di FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS) e la sospensione cellulare verrà centrifugata 50 g per 5 minuti a 4°C. Il surnatante, contenente cellule epatiche non parenchimali (NPC), verrà raccolto in una nuova provetta da 50 mL e il pellet verrà lavato con soluzione tampone fosfato (PBS). HC e NPC verranno congelati in terreni standard 20% FBS 10% DMSO e conservati in azoto liquido fino all'uso.

Un frammento di T e PT verrà conservato nella soluzione RNAlater a -80°C. Per l'identificazione delle CTC, le PBMC saranno scongelate, risospese in terreni standard e selezionate con FACSARIA III (BD bioscience) tramite EpCAM+, CD47+, CD133+. Verrà valutata la percentuale di cellule singole positive (EpCAM+, CD47+ e CD133+) e cellule triple positive (EpCAM/CD47/CD133+++) e verrà calcolato il numero totale di CTC. Le CTC saranno testate per la loro capacità replicativa e invasiva. Utilizzando il test di proliferazione e invasione cellulare valuteremo il tempo di raddoppio delle CTC (tempo necessario affinché le cellule raddoppino in numero), il tasso di crescita (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= il numero di cellule al tempo t, N(0)= il numero di cellule al tempo 0, t= tempo) e il tasso di invasione.

Dopo la caratterizzazione delle CTC analizzeremo HC e NPC, utilizzando i marcatori positivi precedentemente descritti, per valutare l'esatta derivazione epatica delle CTC.

Il materiale biologico verrà spedito tramite trasporto privato specializzato e conservato presso il laboratorio dell'Università degli Studi del Piemonte Orientale.

I modelli di ricorrenza verranno valutati come segue. La recidiva locale sarà definita come una recidiva sullo stesso segmento epatico in caso di resezione con risparmio di parenchima, o sulla barriera chirurgica dei segmenti più vicini in caso di resezione anatomica. Verrà quindi valutato il numero di noduli ricorrenti (singoli versus multipli), la sede della recidiva (intraepatica versus extraepatica o entrambe), la dimensione del nodulo ricorrente principale e il segmento epatico. Tutte queste valutazioni sulla recidiva verranno effettuate mediante TAC o MRI durante il follow-up, come prevedono i protocolli locali di follow-up.

Tutti i pazienti saranno seguiti utilizzando un protocollo locale che include la misurazione di α-FP sierica, bilirubina totale, GGT, ALP, albumina, INR, emocromo, conta degli elettroliti, ecografia, tomografia computerizzata (CT) con contrasto o risonanza magnetica (MRI). e visite in ufficio. I pazienti vengono solitamente controllati ogni 3 mesi durante il primo anno postoperatorio e successivamente ogni 6 mesi. Quando si è verificata la recidiva, i casi vengono discussi in un contesto multidisciplinare, coinvolgendo radiologo, epatologo, chirurgo, radiologo interventista, radioterapista e oncologo. La sopravvivenza globale (OS) è definita come l'intervallo di tempo (in mesi) dall'intervento chirurgico alla morte del paziente. I dati verranno censurati in caso di paziente deceduto allo screening di follow-up. La sopravvivenza libera da malattia (DFS) è definita come l'intervallo di tempo (in mesi) tra l'intervento chirurgico e la recidiva o la morte. In caso di mancata recidiva, i dati verranno censurati alla data dell'ultimo follow-up disponibile. La sopravvivenza tumore-specifica (TSS) è definita come l’intervallo di tempo in mesi tra l’intervento chirurgico e la morte correlata al tumore.