De rol van circulerende tumorcellen als markers van gevorderde ziekte en prognose bij HCC

Vloeibare biopsie kan een betere stratificatie van patiënten mogelijk maken op basis van hun geschatte prognose. Ook bij andere tumoren (bijv. borstkanker), maakt moleculaire karakterisering het niet alleen mogelijk om de pathologische routes die leiden tot het ontstaan ​​en de progressie van tumoren beter te begrijpen, maar ook om specifieke behandelingen aan te sturen die zijn afgestemd op de specificiteit van de ziekte van de patiënt. Vloeibare biopsie is heel gemakkelijk en goedkoop uit te voeren, omdat het bestaat uit een eenvoudig veneus bloedmonster dat door een celsorteerder zal worden onderzocht om specifieke celpopulaties te identificeren.

Bij hepatocellulair carcinoom helpt vaak een verhoogd recidiefpercentage: bij patiënten die curatief zijn behandeld, ontstaat in 70% van de gevallen een recidief. In deze gevallen hadden patiënten vaak een onderliggende inflammatoire leverziekte, zoals cirrose, die als oncogenetische factor de terugval zou kunnen veroorzaken. Cirrose is een bekende risicofactor voor het ontwikkelen van hepatocellulair carcinoom in het algemeen. Hierdoor is het in de klinische praktijk bijna moeilijk te onderscheiden of de nieuwe knobbel die we hebben gediagnosticeerd moet worden beschouwd als een reëel recidief van de eerst behandelde tumor, of als een de-novo voorval dat verband houdt met de onveranderde onderliggende tumorigenese-boost, die effectief kan zijn. pas genezen na een levertransplantatie. Verschillende retrospectieve onderzoeken hebben al het voordeel aangetoond, in termen van ziektevrije overleving en algehele overleving, van een de-novo-voorval ten opzichte van een echte metastatische presentatie. Niemand heeft echter specifieke klinische of morfologische markers gevonden om onderscheid te maken tussen deze twee aandoeningen. Karakterisering van de aard van de terugkerende knobbel is alleen verkregen door genetische en moleculaire evaluatie van de heterogeniteit van de tumor. Niettemin is deze karakterisering tegenwoordig alleen mogelijk met onderzoeksintentie en op basis van histologische specimens, die alleen kunnen worden verstrekt na een eventuele beslissing tot heroperatie om het beschouwde recidief te behandelen. Indicatie over de behandeling van HCC-recidief na een operatie ontbreekt nog steeds. Onze hypothese is gebaseerd op de ‘zaad- en olie’-theorie, die feitelijk gebaseerd is op het bewijs van de aanwezigheid van circulerende tumorcellen (CTC’s) in de bloedbaan. Deze cellen kunnen vanuit de oorspronkelijke tumoren worden verspreid als een kenmerk van vergevorderde kanker, die de eigenschap van invasiviteit al heeft ontwikkeld. Wij zijn van mening dat tumoren in een vroeg stadium geen CTC's, of niet in dezelfde snelheid of kwaliteit, in de bloedbaan afgeven als gevorderde tumoren. We beschouwden een gevorderde tumor als de tumor al een microvasculaire invasie en/of satellitose heeft, wat de histologische tekenen kunnen zijn van een gevorderd en reeds systemisch stadium. Patiënten met CTC's geïdentificeerd bij de vloeibare biopsie kunnen in verband worden gebracht met een verslechterde prognose, wat verantwoordelijk is voor een verhoogd aantal vroege recidieven en algehele recidief, zelfs in geval van transplantatie. Bovendien zou de ‘zaad- en olie’-theorie, geassocieerd met de ‘herplaatsingstheorie’, vanuit bio-oncologisch oogpunt de gevallen van recidief in de transplantatiesetting kunnen rechtvaardigen, wanneer het hele orgaan en de relatieve oncogenetische risicofactoren , wordt behandeld door substitutie. Ten slotte willen we vanuit pathofysiologisch oogpunt aantonen dat terugkerende intra-hepatische knobbeltjes (IM) het gevolg zijn van het zaaien van circulerende tumorcellen, wat een beter begrip van de carcinogenese in die tumoren mogelijk maakt.

• Primaire doelstelling: het evalueren van de associatie tussen variatie in CTC's - bepaald in bloedmonsters - en de algehele overleving en ziektevrije overleving bij HCC-patiënten voor en na de operatie (resectie of transplantatie).
• Secundair doel: evalueren of de positieve identificatie van CTC's in bloedmonsters geassocieerd is met het intra-hepatische metastatische patroon van recidief bij zowel gereseceerde als getransplanteerde patiënten.
• Tertiaire doelstelling: het evalueren en monitoren van de rol van verschillende klinische, biochemische, radiologische en histopathologische variabelen bij het bepalen van het recidief na een operatie en hun uiteindelijke relatie met de aanwezigheid en het aantal CTC's. De inschrijving van patiënten zal worden beoordeeld door de chirurgische afdelingen van deze studie. meestal tijdens het polikliniekbezoek vóór de chirurgische ingreep. Op dat moment zullen patiënten kandidaat zijn voor dit onderzoek, en als zij akkoord gaan met deelname, zullen onderzoekers de schriftelijke toestemming verkrijgen. Ingeschreven patiënten worden gecodeerd met een alfanumeriek nummer om de identiteit te behouden. Onderzoekers die gaan werken in het laboratorium waar de CTC’s worden geanalyseerd, zullen de eigenaar van het monster niet kunnen achterhalen en geen toegang hebben tot de klinische gegevens (blinde analyse).

Vóór de operatie zal voor elke patiënt een vloeibare biopsie uit perifeer bloed worden afgenomen (in dezelfde tijd als de routinematige bloedanalyse). Er zullen monsters worden gebruikt om het aantal en het type CTC's te analyseren door FACSARIA III (BD bioscience). Tijdens de operatie wordt een nieuw stukje van de tumor en de lever die vrijwel gezond is, verzameld door een deskundige patholoog, die de sectie(s) zal gebruiken voor de gebruikelijke histologische evaluatie zoals voorzien door de beste klinische praktijk en internationale richtlijnen. De overige secties worden tijdens verzending naar de laboratoriumeenheid op ijs gehouden. Onderzoekers zullen levende levercellen isoleren en opslaan onder steriele omstandigheden. Vervolgens zullen levercellen worden geanalyseerd met FACSARIA III en worden gebruikt voor verdere in vitro experimenten.

Vloeibare biopsie zal opnieuw worden uitgevoerd op de 30e postoperatieve dag tijdens het eerste poliklinische bezoek, en vervolgens elke zes maanden, in overeenstemming en parallel met de lokale follow-upprotocollen. Vloeibare biopsie uitgevoerd tijdens de follow-up zal worden behandeld als pre-operatief, tijdens de normale tests die voor klinische doeleinden zijn voorzien. De follow-up wordt na 30 maanden afgesloten.

Alle operaties worden uitgevoerd door chirurgen met ruime ervaring in leverchirurgie. De resectietechniek zal de voorkeur van de chirurg hebben, in overeenstemming met het lokale protocol, goede klinische praktijken en nationale richtlijnen. Alle chirurgen hanteerden dezelfde criteria bij het selecteren van de chirurgische strategie: basisvariabelen van leverfunctie, tumorlocatie en -diameter, en aantal knobbeltjes. Restaging Ultrasonography (US) zal voor elke patiënt intraoperatief worden uitgevoerd. Na verwijdering van de tumor zal een patholoog die bij dit onderzoek betrokken is, een monster nemen van de tumor om een ​​vers ingevroren deel van de tumor te verkrijgen, met het bijbehorende gezonde leverweefsel, om dit op te slaan voor verdere analyse. Dit monster moet worden uitgevoerd in overeenstemming met internationale richtlijnen en lokale ethische overeenstemming, en het moet altijd het juiste materiaal garanderen om de histologische diagnose uit te voeren. Als het weefsel dat is verwijderd bij de patiënt die deelneemt aan dit onderzoek het niet mogelijk maakt om het monster voor het onderzoek uit te voeren zonder de optimale histologische diagnose te beïnvloeden, wordt de patiënt uitgesloten van het onderzoek en wordt er geen monster genomen.

Voor alle patiënten wordt 20 ml nuchter bloedmonster verzameld in een steriele vacuümbuis. De afname zal plaatsvinden in dezelfde tijd als de routinematige preoperatieve bloedmonsters of geplande vervolgcontroles, aangezien er geen andere invasieve procedure aan patiënten mag worden aangeboden sinds hun deelname aan het onderzoek. Het bloedmonster wordt bij 4°C bewaard en binnen 6 uur verwerkt. Vervolgens wordt 5 ml gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 3000 rpm gecentrifugeerd. De plasmafase wordt verzameld en in steriele buizen van 1,5 ml verdeeld en tot gebruik of verzending bij -80 °C bewaard. Vervolgens zullen we perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) isoleren via een Ficoll-gradiënt uit de resterende 15 ml. Na isolatie wordt levend PBMC ingevroren in standaard media 20% Foetaal Bovin Serum (FBS) 10% Dymethil Sulfoxide (DMSO) en tot gebruik bewaard in vloeibare stikstof.

Voor alle patiënten zal een leverweefselmonster worden verzameld en het tumorgedeelte (T) zal worden gescheiden van het peritumorgedeelte (PT). Uit T- en PT-weefsel zullen achtereenvolgens menselijke hepatocyten (HC), Kupffer-cellen (KC), lever-sinusoïdale endotheelcellen (LSEC) en menselijke stellaatcellen (HSC) worden geïsoleerd onder steriele omstandigheden. In het kort wordt leverweefsel in een petrischaal geplaatst en met een steriel scalpel gesneden. Vervolgens wordt de gesneden lever gedurende 45 minuten bij 37°C geïncubeerd in een buis van 50 ml met collagenase P (1 mg/ml). Na incubatie wordt collagenase P geïnactiveerd door toevoeging van 20% FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS) en wordt de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 4°C met 50 g gecentrifugeerd. Het supernatant, dat niet-parenchymcellen (NPC) uit de lever bevat, wordt verzameld in een nieuwe buis van 50 ml en de pellet wordt gewassen met fosfaatbufferoplossing (PBS). HC en NPC worden ingevroren in standaardmedia 20% FBS 10% DMSO en tot gebruik opgeslagen in vloeibare stikstof.

Een fragment van T en PT zal worden bewaard in een RNAlater-oplossing bij -80°C. Voor CTC-identificatie wordt PBMC ontdooid, opnieuw gesuspendeerd in standaardmedia en gesorteerd met FACSARIA III (BD bioscience) via EpCAM+, CD47+, CD133+. Het percentage enkelvoudige positieve cellen (EpCAM+, CD47+ en CD133+) en drievoudige positieve cellen (EpCAM/CD47/CD133+++) zullen worden geëvalueerd en het totale CTC-nummer zal worden berekend. CTC zal worden getest op hun replicerend en invasief vermogen. Met behulp van celproliferatie- en invasietesten zullen we de CTC-verdubbelingstijd (de tijd die nodig is om het aantal cellen te verdubbelen), de groeisnelheid (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= het aantal cellen op tijdstip t, N(0)= het aantal cellen op tijdstip 0, t= tijdstip) en invasiesnelheid.

Na CTC-karakterisering zullen we HC en NPC analyseren, met behulp van de eerder beschreven positieve markers, om de exacte CTC-leverafleiding te evalueren.

Het biologische materiaal wordt met deskundig privévervoer verzonden en opgeslagen naar het laboratorium in "Università degli Studi del Piemonte Orientale".

De herhalingspatronen worden als volgt geëvalueerd. Lokaal recidief wordt gedefinieerd als een recidief op hetzelfde leversegment in geval van parenchymsparende resectie, of op de chirurgische haag van de dichtstbijzijnde segmenten in geval van anatomische resectie. Zo zal het aantal terugkerende knobbeltjes (enkelvoudig versus meervoudig), de locatie van het recidief (intrahepatisch versus extrahepatisch of beide), de grootte van de belangrijkste terugkerende knobbel en het leversegment worden geëvalueerd. Al deze evaluaties van het recidief zullen worden uitgevoerd door middel van een CT-scan of MRI-scan tijdens de follow-up, zoals de lokale follow-upprotocollen voorzien.

Alle patiënten zullen worden gevolgd met behulp van een lokaal protocol, inclusief meting van serum-α-FP, totaal bilirubine, GGT, ALP, albumine, INR, bloedbeeld, elektrolytentelling, echografie, contrastcomputertomografie (CT) of magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). en kantoorbezoeken. Patiënten worden gewoonlijk elke 3 maanden gecontroleerd tijdens het eerste postoperatieve jaar en daarna elke 6 maanden. Wanneer het recidief heeft plaatsgevonden, worden de casussen multidisciplinair besproken, waarbij radioloog, hepatoloog, chirurg, interventioneel radioloog, radiotherapeut en oncoloog betrokken zijn. Totale overleving (OS) wordt gedefinieerd als het tijdsinterval (in maanden) vanaf de operatie tot het overlijden van de patiënt. Gegevens worden gecensureerd in geval van verlies van een patiënt bij de vervolgscreening. Ziektevrije overleving (DFS) wordt gedefinieerd als het tijdsinterval (in maanden) vanaf de operatie tot recidief of overlijden. Als er geen herhaling plaatsvindt, worden de gegevens gecensureerd op de datum van de laatste beschikbare follow-up. Tumorspecifieke overleving (TSS) wordt gedefinieerd als het tijdsinterval in maanden tussen de operatie en het tumorgerelateerde overlijden.