Die Rolle zirkulierender Tumorzellen als Marker für fortgeschrittene Erkrankungen und Prognose bei HCC

Die Flüssigbiopsie kann eine bessere Stratifizierung der Patienten entsprechend ihrer geschätzten Prognose ermöglichen. Auch bei anderen Tumoren (z.B. Brustkrebs) ermöglicht die molekulare Charakterisierung nicht nur ein besseres Verständnis der pathologischen Wege, die zur Tumorentstehung und -progression führen, sondern auch die Entwicklung spezifischer Behandlungen, die auf die Besonderheiten der Erkrankung des Patienten zugeschnitten sind. Die Flüssigbiopsie ist sehr einfach und kostengünstig durchzuführen, da sie aus einer einfachen venösen Blutprobe besteht, die mit einem Zellsortierer untersucht wird, um bestimmte Zellpopulationen zu identifizieren.

Beim hepatozellulären Karzinom kommt es häufig zu einer erhöhten Rezidivrate: Patienten, die mit kurativer Absicht behandelt wurden, erleiden in 70 % der Fälle einen Rückfall. In diesen Fällen lag den Patienten häufig eine zugrunde liegende entzündliche Lebererkrankung wie eine Leberzirrhose vor, die als onkogenetischer Faktor den Rückfall auslösen kann. Leberzirrhose ist allgemein ein bekannter Risikofaktor für die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms. Aus diesem Grund ist es in der klinischen Praxis fast schwierig zu unterscheiden, ob der von uns diagnostizierte neue Knoten als echtes Wiederauftreten des zuerst behandelten Tumors oder als De-novo-Ereignis im Zusammenhang mit dem unveränderten zugrunde liegenden Tumorentstehungsschub betrachtet werden sollte, was wirksam sein kann Heilung erst nach Lebertransplantation. Mehrere retrospektive Studien haben bereits den Vorteil eines De-novo-Ereignisses im Hinblick auf das krankheitsfreie Überleben und das Gesamtüberleben gegenüber einer echten Metastasierung gezeigt. Allerdings hat niemand spezifische klinische oder morphologische Marker gefunden, um zwischen diesen beiden Zuständen zu unterscheiden. Die Charakterisierung des wiederkehrenden Knotens konnte nur durch genetische und molekulare Bewertung der Heterogenität des Tumors erfolgen. Dennoch ist diese Charakterisierung heutzutage nur mit Forschungsabsicht und anhand histologischer Proben möglich, die erst nach einer eventuellen Entscheidung über eine erneute Operation zur Behandlung des in Betracht gezogenen Rezidivs bereitgestellt werden könnten. Es fehlen immer noch Hinweise zur Behandlung eines HCC-Rezidivs nach einer Operation. Unsere Hypothese basiert auf der „Samen-und-Öl“-Theorie, die im Wesentlichen auf dem Nachweis des Vorhandenseins zirkulierender Tumorzellen (CTCs) im Blutkreislauf basiert. Diese Zellen können von den ursprünglichen Tumoren ausgebreitet werden, was ein Zeichen für fortgeschrittenen Krebs ist, der bereits die Eigenschaft der Invasivität entwickelt hat. Wir sind der Meinung, dass Tumoren im Frühstadium CTCs nicht oder nicht in der gleichen Geschwindigkeit oder Qualität in den Blutkreislauf freisetzen wie fortgeschrittene Tumoren. Wir betrachteten einen fortgeschrittenen Tumor als einen, der bereits eine mikrovaskuläre Invasion und/oder Satellitose aufweist, was die histologischen Anzeichen eines fortgeschrittenen und bereits systemischen Stadiums sein können. Patienten mit CTCs, die bei der Flüssigbiopsie identifiziert wurden, können mit einer schlechteren Prognose verbunden sein, was zu einer erhöhten Rate an Frührezidiven und Gesamtrezidiven führt, selbst im Falle einer Transplantation. Darüber hinaus kann die mit der „Rehoming-Theorie“ verbundene „Samen-und-Öl“-Theorie aus bioonkologischer Sicht die Fälle von Rezidiven bei der Transplantation des gesamten Organs und die relativen onkogenetischen Risikofaktoren rechtfertigen , wird durch Substitution behandelt. Abschließend wollen wir aus pathophysiologischer Sicht zeigen, dass wiederkehrende intrahepatische Knötchen (IM) auf die Aussaat zirkulierender Tumorzellen zurückzuführen sind, was ein besseres Verständnis der Karzinogenese in diesen Tumoren ermöglicht.

• Hauptziel: Bewertung des Zusammenhangs zwischen der Variation der CTCs – bestimmt in Blutproben – und dem Gesamtüberleben und dem krankheitsfreien Überleben bei HCC-Patienten vor und nach der Operation (entweder Resektion oder Transplantation).
• Sekundäres Ziel: Bewertung, ob die positive Identifizierung von CTCs in Blutproben mit dem intrahepatischen metastatischen Rezidivmuster bei resezierten und transplantierten Patienten verbunden ist.
• Tertiäres Ziel: Bewertung und Überwachung der Rolle verschiedener klinischer, biochemischer, radiologischer und histopathologischer Variablen bei der Bestimmung des Wiederauftretens nach der Operation und ihrer eventuellen Beziehung zum Vorhandensein und der Häufigkeit von CTCs. Die Patientenrekrutierung wird von den chirurgischen Abteilungen dieser Studie beurteilt. in der Regel beim ambulanten Klinikbesuch vor dem chirurgischen Eingriff. In diesem Moment sind Patienten Kandidaten für diese Studie, und wenn sie der Teilnahme zustimmen, holen die Forscher die schriftliche Einwilligung ein. Eingeschriebene Patienten werden zur Wahrung der Identität durch eine alphanumerische Nummer kodiert. Forscher, die in dem Labor beschäftigt sind, in dem die CTCs analysiert werden, können den Eigentümer der Probe nicht ermitteln und haben keinen Zugriff auf die klinischen Daten (Blindanalyse).

Vor der Operation wird für jeden Patienten eine Flüssigkeitsbiopsie aus peripherem Blut entnommen (gleichzeitig mit der routinemäßigen Blutanalyse). Die Proben werden verwendet, um die CTC-Rate und -Typ durch FACSARIA III (BD Bioscience) zu analysieren. Während der Operation wird ein frischer Schnitt des Tumors und der nahezu gesunden Leber von einem erfahrenen Pathologen entnommen, der die Schnitte für die übliche histologische Beurteilung gemäß der besten klinischen Praxis und internationalen Richtlinien verwendet. Die restlichen Abschnitte werden während des Transports zur Laboreinheit auf Eis gehalten. Die Forscher werden die Isolierung und Lagerung lebender Leberzellen unter sterilen Bedingungen durchführen. Anschließend werden Leberzellen mit FACSARIA III analysiert und für weitere In-vitro-Experimente verwendet.

Die Flüssigbiopsie wird erneut am 30. postoperativen Tag beim ersten ambulanten Besuch und dann alle sechs Monate gemäß und parallel zu den örtlichen Nachsorgeprotokollen durchgeführt. Die während der Nachsorge durchgeführte Flüssigkeitsbiopsie wird als präoperative Operation im Rahmen der normalen, für klinische Zwecke vorgesehenen Tests durchgeführt. Das Follow-up wird nach 30 Monaten abgeschlossen.

Alle Operationen werden von Chirurgen mit großer Erfahrung in der Leberchirurgie durchgeführt. Die Resektionstechnik richtet sich nach der Präferenz des Chirurgen und richtet sich nach dem örtlichen Protokoll, der guten klinischen Praxis und den nationalen Richtlinien. Alle Chirurgen wählten die chirurgische Strategie nach denselben Kriterien: Basisvariablen der Leberfunktion, Tumorlokalisation und -durchmesser sowie Anzahl der Knötchen. Bei jedem Patienten wird intraoperativ eine Restaging-Ultraschalluntersuchung (US) durchgeführt. Nach der Tumorentfernung entnimmt ein an dieser Studie beteiligter Pathologe eine Probe aus dem Tumor, um einen frisch gefrorenen Abschnitt des Tumors mit dem dazugehörigen gesunden Lebergewebe zu erhalten und ihn für die weitere Analyse aufzubewahren. Diese Probenahme sollte in Übereinstimmung mit internationalen Richtlinien und lokalen ethischen Vereinbarungen durchgeführt werden und es muss immer gewährleistet sein, dass das richtige Material zur Durchführung der histologischen Diagnose verwendet wird. Wenn das dem an dieser Studie teilnehmenden Patienten entnommene Gewebe keine Entnahme der Probe für die Studie zulässt, ohne die optimale histologische Diagnose zu beeinträchtigen, wird der Patient von der Studie ausgeschlossen und es wird keine Probenahme durchgeführt.

Für alle Patienten werden 20 ml Nüchternblutprobe in einem sterilen Vakuumröhrchen entnommen. Die Entnahme erfolgt gleichzeitig mit routinemäßigen präoperativen Blutproben oder geplanten Nachkontrollen, da den Patienten seit ihrer Aufnahme in die Studie keine weiteren invasiven Eingriffe mehr zur Verfügung gestellt werden sollten. Die Blutprobe wird bei 4 °C gelagert und innerhalb von 6 Stunden verarbeitet. Anschließend werden 5 ml bei 3000 U/min 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert, die Plasmaphase wird gesammelt und in sterilen 1,5-ml-Röhrchen aliquotiert und bis zur Verwendung oder zum Versand bei -80 °C gelagert. Anschließend werden wir aus den verbleibenden 15 ml periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) durch einen Ficoll-Gradienten isolieren. Nach der Isolierung werden lebende PBMC in Standardmedien aus 20 % fetalem Rinderserum (FBS) und 10 % Dymethilsulfoxid (DMSO) eingefroren und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Für alle Patienten wird eine Lebergewebeprobe entnommen und der Tumoranteil (T) vom Peritumoranteil (PT) getrennt. Aus T- und PT-Gewebe werden anschließend unter sterilen Bedingungen menschliche Hepatozyten (HC), Kupffer-Zellen (KC), Lebersinus-Endothelzellen (LSEC) und menschliche Stellatzellen (HSC) isoliert. Kurz gesagt, Lebergewebe wird in eine Petrischale gelegt und mit einem sterilen Skalpell geschnitten. Anschließend wird die geschnittene Leber in einem 50-ml-Röhrchen mit Kollagenase P (1 mg/ml) 45 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird Kollagenase P durch Zugabe von 20 % FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS) inaktiviert und die Zellsuspension wird 5 Minuten lang bei 4 °C mit 50 g zentrifugiert. Der Überstand, der nicht-parenchymale Leberzellen (NPC) enthält, wird in einem neuen 50-ml-Röhrchen gesammelt und das Pellet wird mit Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen. HC und NPC werden in Standardmedien (20 % FBS, 10 % DMSO) eingefroren und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Ein Fragment von T und PT wird in RNAlater-Lösung bei -80 °C gelagert. Zur CTC-Identifizierung werden PBMC aufgetaut, in Standardmedien resuspendiert und mit FACSARIA III (BD Bioscience) über EpCAM+, CD47+, CD133+ sortiert. Der Prozentsatz einzelner positiver Zellen (EpCAM+, CD47+ und CD133+) und dreifach positiver Zellen (EpCAM/CD47/CD133+++) wird ausgewertet und die Gesamt-CTC-Zahl berechnet. CTC werden auf ihre replikative und invasive Fähigkeit getestet. Mithilfe des Zellproliferations- und Invasionsassays werden wir die CTC-Verdoppelungszeit (die Zeit, die die Zellen benötigen, um ihre Zahl zu verdoppeln) und die Wachstumsrate (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= die Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt t, N(0)= die Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt 0, t= Zeit) und Invasionsrate.

Nach der CTC-Charakterisierung analysieren wir HC und NPC unter Verwendung der zuvor beschriebenen positiven Marker, um die genaue hepatische CTC-Ableitung zu bewerten.

Das biologische Material wird per fachkundigem Privattransport verschifft und im Labor der „Università degli Studi del Piemonte Orientale“ gelagert.

Die Wiederholungsmuster werden wie folgt ausgewertet. Als lokales Rezidiv wird im Falle einer Parenchym-schonenden Resektion ein Rezidiv im selben Lebersegment oder im Falle einer anatomischen Resektion an der chirurgischen Absicherung der nächstgelegenen Segmente definiert. Daher wird die Anzahl der wiederkehrenden Knötchen (einzeln oder mehrfach), der Ort des Wiederauftretens (intrahepatisch oder extrahepatisch oder beides), die Größe des wichtigsten wiederkehrenden Knotens und das Lebersegment bewertet. Alle diese Auswertungen zum Wiederauftreten werden während der Nachsorge mittels CT-Scan oder MRT-Scan durchgeführt, wie in den lokalen Nachsorgeprotokollen vorgesehen.

Alle Patienten werden anhand eines lokalen Protokolls überwacht, einschließlich der Messung von Serum-α-FP, Gesamtbilirubin, GGT, ALP, Albumin, INR, Blutbild, Elektrolytzahl, Ultraschall, Kontrast-Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT). und Bürobesuche. Die Patienten werden im ersten postoperativen Jahr in der Regel alle drei Monate und danach alle sechs Monate untersucht. Wenn das Rezidiv auftrat, werden die Fälle in einem multidisziplinären Rahmen besprochen, an dem Radiologen, Hepatologen, Chirurgen, interventionelle Radiologen, Strahlentherapeuten und Onkologen beteiligt sind. Das Gesamtüberleben (OS) ist definiert als Zeitintervall (in Monaten) von der Operation bis zum Tod des Patienten. Im Falle eines entlassenen Patienten werden die Daten beim Nachuntersuchungsscreening zensiert. Das krankheitsfreie Überleben (Disease Free Survival, DFS) ist definiert als Zeitintervall (in Monaten) von der Operation bis zum Wiederauftreten oder Tod. Tritt kein erneutes Auftreten auf, werden die Daten zum Datum der letzten verfügbaren Nachuntersuchung zensiert. Das tumorspezifische Überleben (TSS) ist definiert als die Zeitspanne in Monaten zwischen der Operation und dem tumorbedingten Tod.