O papel das células tumorais circulantes como marcadores de doença avançada e prognóstico no CHC

A biópsia líquida pode permitir uma melhor estratificação dos pacientes de acordo com o prognóstico estimado. Também em outros tumores (por ex. câncer de mama), a caracterização molecular permite não apenas compreender melhor as vias patológicas que levam à tumorigênese e à progressão, mas também conduzir tratamentos específicos adaptados à especificidade da doença do paciente. A biópsia líquida é muito fácil e barata de realizar, pois consiste em uma simples amostra de sangue venoso que será investigada pelo classificador de células para identificar populações específicas de células.

No carcinoma hepatocelular é comum assistir a uma elevada taxa de recorrência: pacientes que foram tratados com intenção curativa, em 70% dos casos recidivam. Nestes casos, os pacientes frequentemente apresentavam uma doença hepática inflamatória subjacente, como cirrose, que pode levar à recidiva como fator oncogenético. A cirrose é um fator de risco bem conhecido para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular em geral. Por causa disso, na prática clínica é quase difícil distinguir se o novo nódulo que diagnosticamos deve ser considerado como uma recorrência real do primeiro tumor tratado, ou uma ocorrência de novo ligada ao aumento inalterado da tumorigênese subjacente, que pode ser efetivamente curado somente após transplante de fígado. Vários estudos retrospectivos já demonstraram a vantagem, em termos de sobrevivência livre de doença e sobrevivência global, de uma ocorrência de novo em relação a uma apresentação metastática real. No entanto, ninguém alcançou marcadores clínicos ou morfológicos específicos para distinguir entre estas duas condições. A caracterização da natureza do nódulo recorrente foi obtida apenas pela avaliação genética e molecular da heterogeneidade dos tumores. No entanto, esta caracterização hoje em dia só é possível com intenção de pesquisa e em peça histológica, que só poderá ser fornecida após uma eventual decisão de refazer a cirurgia para tratar a recidiva considerada. Ainda falta indicação sobre como tratar a recorrência do CHC após a cirurgia. Nossa hipótese está fundamentada na teoria da “semente e óleo”, que se baseia basicamente na evidência da presença de células tumorais circulantes (CTCs) na corrente sanguínea. Essas células podem se espalhar a partir dos tumores originais como uma marca registrada do câncer avançado, que já desenvolveu a característica de invasão. É nossa opinião que os tumores em estágio inicial não liberam, ou não liberam CTCs na corrente sanguínea, ou não na mesma taxa ou qualidade, como o faz o tumor avançado. Consideramos tumor avançado aquele que já apresenta invasão microvascular e/ou satelitose, que podem ser sinais histológicos de estágio avançado e já sistêmico. Pacientes com CTCs identificadas na biópsia líquida podem estar associados a um pior prognóstico, sendo responsáveis ​​por um aumento na taxa de recorrência precoce e recorrência global, mesmo em caso de transplante. Além disso, a teoria da "semente e óleo", associada à "teoria do realojamento", pode justificar, do ponto de vista bio-oncológico, os casos de recorrência no cenário do transplante, quando todo o órgão, e os fatores de risco oncogenéticos relativos , é tratado por substituição. Finalmente, do ponto de vista fisiopatológico, queremos demonstrar que os nódulos intra-hepáticos (MI) recorrentes são devidos à disseminação de células tumorais circulantes, permitindo uma melhor compreensão da carcinogênese nesses tumores.

• Objetivo primário: avaliar a associação entre a variação nas CTCs - determinadas em amostras de sangue - e sobrevida global e sobrevida livre de doença em pacientes com CHC antes e depois da cirurgia (ressecção e transplante).
• Objetivo secundário: avaliar se a identificação positiva de CTCs em amostras de sangue está associada ao padrão metastático intra-hepático de recorrência em pacientes ressecados e transplantados.
• Objetivo terciário: avaliar e monitorar o papel de diferentes variáveis ​​clínicas, bioquímicas, radiológicas e histopatológicas na determinação da recorrência após a cirurgia e sua eventual relação com a presença e taxa de CTCs. A inscrição dos pacientes será avaliada pelas divisões cirúrgicas deste estudo, geralmente durante a consulta ambulatorial antes da operação cirúrgica. Nesse momento os pacientes serão candidatos a este estudo e, caso aceitem participar, os pesquisadores obterão o consentimento por escrito. Os pacientes inscritos serão codificados por um número alfanumérico para preservar a identidade. Os pesquisadores que trabalharão no laboratório onde serão analisadas as CTCs não poderão rastrear o dono da amostra e não terão acesso aos dados clínicos (análise cega).

Antes da cirurgia para cada paciente será coletada biópsia líquida de sangue periférico (no mesmo horário da análise de sangue de rotina). As amostras serão utilizadas para analisar a taxa e o tipo de CTCs pelo FACSARIA III (BD bioscience). Durante a cirurgia, uma nova fatia do tumor e do fígado quase saudável será coletada por um patologista especialista, que usará a(s) seção(ões) para a avaliação histológica usual, conforme fornecido pelas melhores práticas clínicas e diretrizes internacionais. As demais seções serão mantidas em gelo durante o envio para a unidade laboratorial. Os pesquisadores realizarão o isolamento e armazenamento de células hepáticas vivas em condições estéreis. Em seguida, as células hepáticas serão analisadas com FACSARIA III e utilizadas para posteriores experimentos in vitro.

A biópsia líquida será realizada novamente no 30º dia de pós-operatório na primeira consulta ambulatorial e, a seguir, a cada seis meses, de acordo e paralelamente aos protocolos de acompanhamento local. A biópsia líquida realizada durante o acompanhamento será tratada como pré-operatória, durante os exames normais fornecidos para fins clínicos. O acompanhamento será encerrado em 30 meses.

Todas as operações serão realizadas por cirurgiões com grande experiência em cirurgia hepática. A técnica de ressecção será de preferência do cirurgião, de acordo com o protocolo local, boas práticas clínicas e diretrizes nacionais. Todos os cirurgiões adotaram os mesmos critérios para selecionar a estratégia cirúrgica: variáveis ​​basais de função hepática, localização e diâmetro do tumor e número de nódulos. A ultrassonografia (US) de reestadiamento será realizada no intra-operatório para cada paciente. Após a remoção do tumor, um patologista envolvido neste estudo irá coletar uma amostra do tumor para obter uma seção recém-congelada do tumor, com o tecido hepático saudável relacionado, para armazená-lo para análise posterior. Esta amostra deve ser realizada de acordo com as diretrizes internacionais e acordo ético local, devendo sempre garantir o material correto para realizar o diagnóstico histológico. Se o tecido removido do paciente inscrito neste estudo não permitir a realização da amostra para o estudo sem afetar o diagnóstico histológico ideal, o paciente será excluído do estudo e nenhuma amostragem será executada.

Para todos os pacientes, 20 mL de amostra de sangue em jejum serão coletados em um tubo a vácuo estéril. A coleta será feita no mesmo horário das amostras de sangue pré-operatórias de rotina ou controles de acompanhamento planejados, uma vez que nenhum outro procedimento invasivo deve ser fornecido aos pacientes desde sua inscrição no estudo. A amostra de sangue será armazenada a 4°C e manuseada em 6 horas. Em seguida, 5 mL serão centrifugados a 3.000 rpm por 10 minutos a 4°C, a fase plasmática será coletada e aliquotada em tubos estéreis de 1,5 mL e armazenada a -80°C até o uso ou envio. Em seguida, isolaremos as células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) através do gradiente de Ficoll dos 15 mL restantes. Após o isolamento, PBMC vivos serão congelados em meio padrão 20% Soro Fetal Bovino (FBS) 10% Dimetil Sulfóxido (DMSO) e armazenados em nitrogênio líquido até o uso.

Para todos os pacientes, uma amostra de tecido hepático será coletada e a porção do tumor (T) será separada da porção peritumoral (PT). A partir dos tecidos T e PT serão isolados consequentemente Hepatócitos Humanos (HC), células de Kupffer (KC), Células Endoteliais Sinusoidais do Fígado (LSEC) e Células Estreladas Humanas (HSC) em condições estéreis. Resumidamente, o tecido hepático será colocado em uma placa de Petri e cortado com bisturi estéril. Em seguida, o fígado cortado será incubado em tubo de 50 mL com colagenase P (1mg/mL) a 37°C por 45 minutos. Após a incubação, a colagenase P será inativada adicionando 20% de FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS) e a suspensão celular será centrifugada 50g 5 minutos a 4°C. O sobrenadante, contendo células não parenquimatosas do fígado (NPC), será coletado em um novo tubo de 50 mL e o pellet será lavado com Solução Tampão Fosfato (PBS). HC e NPC serão congelados em meio padrão 20% FBS 10% DMSO e armazenados em nitrogênio líquido até o uso.

Um fragmento de T e PT será armazenado em solução RNAlater a -80°C. Para identificação de CTC, as PBMC serão descongeladas, ressuspensas em meio padrão e classificadas com FACSARIA III (BD bioscience) através de EpCAM+, CD47+, CD133+. A porcentagem de células positivas únicas (EpCAM+, CD47+ e CD133+) e células positivas triplas (EpCAM/CD47/CD133+++) será avaliada e o número total de CTC será calculado. O CTC será testado quanto à sua capacidade replicativa e invasiva. Usando ensaio de proliferação e invasão celular avaliaremos o tempo de duplicação de CTC (tempo necessário para as células dobrarem em número), taxa de crescimento (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= o número de células no tempo t, N(0)= o número de células no tempo 0, t= tempo) e taxa de invasão.

Após a caracterização da CTC analisaremos HC e NPC, utilizando os marcadores positivos descritos anteriormente, a fim de avaliar a exata derivação hepática da CTC.

O material biológico será enviado em transporte privado especializado e armazenado no laboratório da "Università degli Studi del Piemonte Orientale".

Os padrões de recorrência serão avaliados a seguir. A recorrência local será definida como uma recorrência no mesmo segmento hepático em caso de Ressecção Preservadora de Parênquima, ou na cobertura cirúrgica dos segmentos mais próximos em caso de Ressecção Anatômica. Assim, serão avaliados o número de nódulos recorrentes (únicos versus múltiplos), a localização da recorrência (intra-hepática versus extra-hepática ou ambos), o tamanho do nódulo recorrente principal e o segmento hepático. Todas essas avaliações de recorrência serão feitas por tomografia computadorizada ou ressonância magnética durante o acompanhamento, conforme previsto pelos protocolos de acompanhamento locais.

Todos os pacientes serão acompanhados usando um protocolo local, incluindo medição de α-FP sérico, bilirrubina total, GGT, ALP, Albumina, INR, hemograma, contagem de eletrólitos, ultrassom, contraste Tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (MRI) e visitas ao escritório. Os pacientes geralmente são examinados a cada 3 meses durante o primeiro ano pós-operatório e a cada 6 meses a partir de então. Quando ocorre a recorrência, os casos são discutidos em ambiente multidisciplinar, envolvendo radiologista, hepatologista, cirurgião, radiologista intervencionista, radioterapeuta e oncologista. A sobrevivência geral (SG) é definida como o intervalo de tempo (em meses) desde a cirurgia até a morte do paciente. Os dados serão censurados em caso de paciente solto na triagem de acompanhamento. A Sobrevivência Livre de Doença (SLD) é definida como o intervalo de tempo (em meses) desde a cirurgia até a recorrência ou morte. Caso não haja recorrência, os dados serão censurados na data do último acompanhamento disponível. A sobrevivência específica do tumor (TSS) é definida como o intervalo de tempo em meses entre a cirurgia e a morte relacionada ao tumor.