Cirkulerende tumorcellers rolle som markører for avanceret sygdom og prognose i HCC

Væskebiopsi kan muliggøre en bedre stratificering af patienter i henhold til deres estimerede prognose. Såvel i andre tumorer (f.eks. brystkræft), giver molekylær karakterisering ikke kun mulighed for bedre at forstå de patologiske veje, der fører til tumorgenese og progression, men også at drive specifikke behandlinger skræddersyet til patientsygdommens specificitet. Flydende biopsi er meget let og billig at udføre, da den består af en simpel venøs blodprøve, som vil blive undersøgt af cellesortering for at identificere specifikke populationer af celler.

I hepatocellulært karcinom er det almindeligt at hjælpe på en forhøjet recidivrate: patienter, der er blevet behandlet med en helbredende hensigt, får i 70% af tilfældene tilbagefald. I disse tilfælde havde patienterne ofte en underliggende inflammatorisk leversygdom, som skrumpelever, som kan drive tilbagefaldet som en onkogenetisk faktor. Cirrose er en velkendt risikofaktor for udvikling af hepatocellulært karcinom generelt. På grund af dette er det i klinisk praksis næsten vanskeligt at skelne, om den nye knude, vi har diagnosticeret, skal betragtes som en reel gentagelse af den først behandlede tumor, eller en de-novo forekomst forbundet med den uændrede underliggende tumorgenese-boost, hvilket kan være effektivt. helbredes først efter levertransplantation. Adskillige retrospektive undersøgelser har allerede vist fordelen med hensyn til sygdomsfri-overlevelse og samlet overlevelse ved en de-novo-forekomst i forhold til en reel metastatisk præsentation. Ingen har dog nået nogen specifikke kliniske eller morfologiske markører for at skelne mellem disse to tilstande. Karakterisering af arten af ​​den tilbagevendende knude er kun opnået ved genetisk og molekylær evaluering af tumorernes heterogenitet. Ikke desto mindre er denne karakterisering i dag kun mulig med forskningshensigt og på histologiske prøver, som kun kunne gives efter en eventuel beslutning om genoperation for at behandle det overvejede gentagelse. Der mangler stadig indikation om, hvordan man behandler HCC-tilbagefald efter operation. Vores hypotese er baseret på "frø og olie"-teorien, som grundlæggende er baseret på beviser for tilstedeværelsen af ​​cirkulerende tumorceller (CTC'er) i blodbanen. Disse celler kan spredes fra de oprindelige tumorer som et kendetegn for fremskreden cancer, som allerede har udviklet invasivitetskarakteristikken. Det er vores opfattelse, at tumorer i et tidligt stadie ikke frigiver, eller ikke i samme hastighed eller kvalitet, CTC'er i blodbanen, som fremskreden tumor gør. Vi betragtede en fremskreden tumor som den, der allerede har mikrovaskulær invasion og/eller satellitose, hvilket kan være de histologiske tegn på et fremskredent og allerede systemisk stadium. Patienter med CTC'er identificeret ved den flydende biopsi kan være forbundet med en forværret prognose, hvilket tegner sig for en øget frekvens af tidligt tilbagefald og generelt recidiv, selv i tilfælde af transplantation. Derudover kan "frø og olie"-teorien, der er forbundet med "rehoming-teorien" ud fra et bio-onkologisk synspunkt retfærdiggøre tilfælde af recidiv i transplantationsmiljøet, når hele organet, og de relative onkogenetiske risikofaktorer , behandles ved substitution. Endelig, fra et patofysiologisk synspunkt, ønsker vi at demonstrere, at tilbagevendende intrahepatiske knuder (IM) skyldes cirkulerende tumorcellers udsåning, hvilket muliggør en bedre forståelse af carcinogenese i disse tumorer.

• Primært mål: at evaluere sammenhængen mellem variation i CTC'er - bestemt i blodprøver - og samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse hos HCC-patienter før og efter operation (enten resektion og transplantation).
• Sekundært mål: at evaluere, om den positive identifikation af CTC'er i blodprøver er forbundet med det intrahepatiske metastatiske mønster af tilbagefald hos enten resekerede patienter og transplanterede patienter.
• Tertiært mål: at evaluere og overvåge rollen af ​​forskellige kliniske, biokemiske, radiologiske og histopatologiske variabler i bestemmelsen af ​​recidiv efter operationen og deres eventuelle sammenhæng med tilstedeværelsen og frekvensen af ​​CTC'er. Patientindskrivning vil blive vurderet af de kirurgiske afdelinger i denne undersøgelse, normalt under ambulatoriebesøget før den kirurgiske operation. I det øjeblik vil patienter være kandidater til denne undersøgelse, og hvis de accepterer at deltage, vil forskerne opnå det skriftlige samtykke. Tilmeldte patienter vil blive kodificeret med et alfanumerisk nummer for at bevare identiteten. Forskere, der vil blive ansat i laboratoriet, hvor CTC'erne skal analyseres, vil ikke være i stand til at spore ejeren af ​​prøven, og de vil ikke have adgang til de kliniske data (blind analyse).

Før operationen for hver patient vil der blive indsamlet flydende biopsi fra perifert blod (på samme tidspunkt med rutinemæssig blodanalyse). Prøver vil blive brugt til at analysere CTCs hastighed og type ved FACSARIA III (BD biovidenskab). Under operationen vil en frisk skive af tumoren og lever næsten blive indsamlet af en ekspert patolog, som vil bruge sektion(er) til den sædvanlige histologiske evaluering som angivet i den bedste kliniske praksis og internationale retningslinjer. De resterende sektioner vil blive holdt på is under forsendelse til laboratorieenheden. Forskere vil udføre levende leverceller isolering og opbevaring under sterile forhold. Derefter vil leverceller blive analyseret med FACSARIA III og brugt til yderligere in vitro eksperimenter.

Væskebiopsi vil blive udført igen den 30. postoperative dag under det første ambulante besøg, og derefter hver sjette måned, i overensstemmelse med og parallelt med de lokale opfølgningsprotokoller. Flydende biopsi, der udføres under opfølgningen, vil blive behandlet som den præoperative, under de normale tests, der leveres til kliniske formål. Opfølgningen lukkes efter 30 måneder.

Alle operationer vil blive udført af kirurger med stor erfaring i leverkirurgi. Resektionsteknikken vil være efter kirurgens præference i henhold til lokal protokol, god klinisk praksis og nationale retningslinjer. Alle kirurger vedtog de samme kriterier for at vælge den kirurgiske strategi: baselinevariabler for leverfunktion, tumorplacering og -diameter og antal knuder. Restaging ultralyd (US) vil blive udført intraoperativt for hver patient. Efter tumorfjernelse vil en patolog, der er involveret i denne undersøgelse, prøve tumoren for at få et friskfrosset snit af tumoren med det relaterede sunde levervæv for at opbevare det til yderligere analyse. Denne prøve skal udføres i overensstemmelse med internationale retningslinjer og lokal etisk aftale, og den skal altid garantere det korrekte materiale til at udføre den histologiske diagnose. Hvis vævet, der er fjernet fra patienten, der er inkluderet i denne undersøgelse, ikke tillader at udføre prøven til undersøgelsen uden at påvirke den optimale histologiske diagnose, vil patienten blive udelukket fra undersøgelsen, og ingen prøveudtagning vil blive udført.

For alle patienter vil 20 ml fastende blodprøve blive opsamlet i et sterilt vakuumrør. Indsamlingen vil blive foretaget på samme tid med rutinemæssige præoperative blodprøver eller planlagte opfølgningskontroller, da ingen andre invasive procedurer bør gives til patienterne siden deres tilmelding til undersøgelsen. Blodprøven opbevares ved 4°C og håndteres inden for 6 timer. Derefter vil 5 mL blive centrifugeret ved 3000 rpm i 10 minutter ved 4°C, plasmafasen vil blive opsamlet og fordelt i 1,5 mL sterile rør og opbevaret ved -80°C indtil brug eller forsendelse. Derefter vil vi isolere perifere blod mononukleære celler (PBMC) gennem Ficoll gradient fra de resterende 15 ml. Efter isolering vil levende PBMC blive frosset i standardmedier 20% føtalt bovinserum (FBS) 10% Dymethil Sulfoxide (DMSO) og opbevaret i flydende nitrogen indtil brug.

For alle patienter vil der blive indsamlet levervævsprøve, og tumor (T) del vil blive adskilt fra peritumor (PT) del. Fra T- og PT-væv vil konsekvent blive isoleret humane hepatocytter (HC), Kupffer-celler (KC), sinusoidale endotelceller fra leveren (LSEC) og humane stellateceller (HSC) under sterile forhold. Kort fortalt vil levervæv blive anbragt i en petriskål og skåret med steril skalpel. Derefter inkuberes skåret lever i et 50 ml rør med collagenase P (1mg/ml) ved 37°C i 45 minutter. Efter inkubation inaktiveres collagenase P ved tilsætning af 20 % FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS), og cellesuspension vil blive centrifugeret 50 g 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten, der indeholder ikke-parenkymale leverceller (NPC), vil blive opsamlet i et nyt 50 ml rør, og pellet vil blive vasket med Phosphate Buffer Solution (PBS). HC og NPC vil blive frosset i standardmedier 20% FBS 10% DMSO og opbevaret i flydende nitrogen indtil brug.

Et fragment af T og PT vil blive opbevaret i RNAlater-opløsning ved -80°C. Til CTC-identifikation vil PBMC blive optøet, resuspenderet i standardmedier og sorteret med FACSARIA III (BD bioscience) gennem EpCAM+, CD47+, CD133+. Procentdelen af ​​enkelte positive celler (EpCAM+, CD47+ og CD133+) og tredobbelte positive celler (EpCAM/CD47/CD133+++) vil blive evalueret, og det samlede CTC-tal vil blive beregnet. CTC vil blive testet for deres replikative og invasive kapacitet. Ved hjælp af celleproliferation og invasionsassay vil vi evaluere CTC-fordoblingstid (tid nødvendig for cellerne at fordoble i antal), væksthastighed (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= antallet af celler på tidspunktet t, N(0)= antallet af celler på tidspunktet 0, t=tidspunktet) og invasionshastigheden.

Efter CTC-karakterisering vil vi analysere HC og NPC ved hjælp af de positive markører, der tidligere er beskrevet, for at evaluere den nøjagtige CTC-leverafledning.

Det biologiske materiale vil blive sendt af ekspert privat transport og opbevaret til laboratoriet i "Università degli Studi del Piemonte Orientale".

Gentagelsesmønstrene vil blive evalueret som følger. Lokalt recidiv vil blive defineret som et recidiv på det samme leversegment i tilfælde af Parenchyma Sparing Resection, eller på den kirurgiske hedge af de nærmeste segmenter i tilfælde af anatomisk resektion. Det vil således blive evalueret antallet af recidiverende knuder (enkelt versus multiple), placeringen af ​​recidiv (intrahepatisk versus ekstrahepatisk eller begge), størrelsen af ​​den primære recidiverende knude og leversegmentet. Alle disse evalueringer om recidiv vil blive foretaget ved CT-scanning eller MR-scanning under opfølgningen, som de lokale opfølgningsprotokoller giver.

Alle patienter vil blive fulgt ved hjælp af en lokal protokol inklusive måling af serum α-FP, total bilirubin, GGT, ALP, Albumin, INR, blodtal, elektrolyttælling, ultralyd, kontrastcomputertomografi (CT) eller magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og kontorbesøg. Patienter kontrolleres normalt hver 3. måned i det første postoperative år og derefter hver 6. måned. Når tilbagefaldet opstod, diskuteres tilfældene i et tværfagligt miljø, hvor radiolog, hepatolog, kirurg, interventionel radiolog, radioterapeut og onkolog er involveret. Overall-Survival (OS) er defineret som tidsinterval (i måneder) fra operation til patientens død. Data vil blive censureret i tilfælde af mistet patient ved opfølgningsscreeningen. Sygdomsfri overlevelse (DFS) er defineret som tidsinterval (i måneder) fra operation til tilbagefald eller død. I tilfælde af ingen gentagelse, vil data blive censureret på datoen for den sidste tilgængelige opfølgning. Tumor-specifik overlevelse (TSS) er defineret som tidsintervallet i måneder mellem operation og tumorrelateret død.