Role cirkulujících nádorových buněk jako markerů pokročilého onemocnění a prognózy u HCC

Tekutá biopsie může umožnit lepší stratifikaci pacientů podle jejich odhadované prognózy. Stejně tak u jiných nádorů (např. rakovina prsu), molekulární charakterizace umožňuje nejen lépe porozumět patologickým cestám, které vedou ke vzniku a progresi tumoru, ale také řídit specifickou léčbu přizpůsobenou specifičnosti onemocnění pacienta. Tekutá biopsie je velmi snadná a levná, protože sestává z jednoduchého vzorku žilní krve, který bude vyšetřován třídičem buněk, aby se identifikovaly specifické populace buněk.

U hepatocelulárního karcinomu je běžné napomáhat zvýšené míře recidivy: pacienti, kteří byli léčeni s kurativním záměrem, v 70 % případů relapsují. V těchto případech měli pacienti často základní zánětlivé onemocnění jater, jako je cirhóza, která může vést k relapsu jako onkogenetický faktor. Cirhóza je obecně dobře známým rizikovým faktorem pro rozvoj hepatocelulárního karcinomu. Z tohoto důvodu je v klinické praxi téměř obtížné rozlišit, zda by nový uzel, který jsme diagnostikovali, měl být považován za skutečnou recidivu prvního léčeného nádoru, nebo za de-novo výskyt spojený s nezměněným základním posílením tumorigeneze, což může být účinně vyléčit až po transplantaci jater. Několik retrospektivních studií již prokázalo výhodu, pokud jde o přežití bez onemocnění a celkové přežití, de-novo výskytu ve vztahu ke skutečné metastatické prezentaci. Nikdo však nedosáhl žádných specifických klinických nebo morfologických markerů, které by rozlišovaly mezi těmito dvěma stavy. Charakterizace recidivujícího uzlu byla získána pouze genetickým a molekulárním hodnocením heterogenity nádorů. Tato charakterizace je však v dnešní době možná pouze s výzkumným záměrem a na histologickém vzorku, který by mohl být poskytnut až po případném rozhodnutí o reoperaci k léčbě uvažované recidivy. Indikace, jak léčit recidivu HCC po operaci, zatím chybí. Naše hypotéza je založena na teorii "seed and oil", která je v podstatě založena na důkazech přítomnosti cirkulujících nádorových buněk (CTC) v krevním řečišti. Tyto buňky se mohou šířit z původních nádorů jako charakteristický znak pokročilé rakoviny, která již vyvinula charakteristiku invazivity. Domníváme se, že nádory v časném stadiu neuvolňují nebo neuvolňují ve stejné rychlosti nebo kvalitě CTC do krevního řečiště jako pokročilý nádor. Za pokročilý nádor jsme považovali ten, který již může mít mikrovaskulární invazi a/nebo satelitózu, což mohou být histologické známky pokročilého a již systémového stadia. Pacienti s CTC zjištěnými při tekuté biopsii mohou být spojeni se zhoršenou prognózou, což odpovídá zvýšené míře časné recidivy a celkové recidivy, a to i v případě transplantace. Teorie „semena a oleje“ spojená s „teorií rehomingu“ navíc může z bioonkologického hlediska ospravedlnit případy recidivy v prostředí transplantace, kdy celý orgán a relativní onkogenetické rizikové faktory , se léčí substitucí. Nakonec z patofyziologického hlediska chceme prokázat, že recidivující intrahepatické noduly (IM) jsou způsobeny výsevem cirkulujících nádorových buněk, což umožňuje lepší pochopení karcinogeneze u těchto nádorů.

• Primární cíl: vyhodnotit souvislost mezi variacemi v CTC – stanovenou ve vzorcích krve – a celkovým přežitím a přežitím bez onemocnění u pacientů s HCC před a po operaci (buď resekci a transplantaci).
• Sekundární cíl: vyhodnotit, zda je pozitivní identifikace CTC ve vzorcích krve spojena s intrahepatálním metastatickým vzorem recidivy jak u resekovaných pacientů, tak u pacientů po transplantaci.
• Terciární cíl: vyhodnotit a monitorovat roli různých klinických, biochemických, radiologických a histopatologických proměnných při určování recidivy po operaci a jejich případného vztahu s přítomností a četností CTC Zařazení pacientů bude hodnoceno chirurgickými odděleními této studie, obvykle při návštěvě ambulance před chirurgickým výkonem. V tu chvíli budou pacienti kandidáty na tuto studii, a pokud přijmou účast, výzkumníci získají písemný souhlas. Zapsaní pacienti budou pro zachování identity kódováni alfanumerickým číslem. Výzkumníci, kteří budou zaměstnáni v laboratoři, kde budou CTC analyzovány, nebudou moci dohledat vlastníka vzorku a nebudou mít přístup ke klinickým datům (slepá analýza).

Před operací bude každému pacientovi odebrána tekutá biopsie z periferní krve (současně s rutinní analýzou krve). Vzorky budou použity k analýze míry a typu CTC pomocí FACSARIA III (BD bioscience). Během chirurgického zákroku bude odborným patologem odebrán čerstvý řez nádoru a téměř zdravá játra, která použije řezy k obvyklému histologickému vyhodnocení podle nejlepší klinické praxe a mezinárodních směrnic. Zbývající sekce budou během přepravy do laboratorní jednotky udržovány na ledu. Vědci budou provádět izolaci a skladování živých jaterních buněk za sterilních podmínek. Poté budou jaterní buňky analyzovány pomocí FACSARIA III a použity pro další experimenty in vitro.

Tekutá biopsie bude znovu provedena 30. pooperační den při první ambulantní návštěvě a poté každých šest měsíců v souladu a souběžně s místními kontrolními protokoly. Tekutá biopsie prováděná během sledování bude vedena jako předoperační, během běžných testů poskytovaných pro klinické účely. Následná kontrola bude uzavřena po 30 měsících.

Všechny operace budou provádět chirurgové s velkými zkušenostmi s jaterní chirurgií. Resekční technika bude preferována chirurgem podle místního protokolu, dobré klinické praxe a národních doporučení. Všichni chirurgové přijali stejná kritéria pro výběr chirurgické strategie: základní proměnné jaterní funkce, umístění a průměr nádoru a počet uzlů. Restaging Ultrasonografie (US) bude provedena peroperačně u každého pacienta. Po odstranění nádoru odebere patolog zapojený do této studie vzorek nádoru, aby získal čerstvě zmrazenou část nádoru s příslušnou zdravou jaterní tkání, aby jej uložil pro další analýzu. Tento vzorek by měl být proveden v souladu s mezinárodními směrnicemi a místní etickou dohodou a vždy musí zaručit správný materiál pro provedení histologické diagnostiky. Pokud tkáň odebraná pacientovi zařazenému do této studie neumožňuje provést vzorek pro studii bez ovlivnění optimální histologické diagnózy, bude pacient ze studie vyloučen a nebude proveden žádný odběr.

Všem pacientům bude odebráno 20 ml vzorku krve nalačno do sterilní vakuové zkumavky. Odběr bude proveden ve stejnou dobu jako rutinní předoperační odběry krve nebo plánované následné kontroly, protože od jejich zařazení do studie by pacientům neměl být poskytnut žádný jiný invazivní postup. Vzorek krve bude uchováván při 4°C a zpracován do 6 hodin. Poté se 5 ml odstřeďuje při 3000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při 4 °C, plazmatická fáze se shromáždí a rozdělí na alikvoty do 1,5 ml sterilních zkumavek a skladuje při -80 °C až do použití nebo odeslání. Poté izolujeme mononukleární buňky periferní krve (PBMC) přes Ficoll gradient ze zbývajících 15 ml. Po izolaci budou živé PBMC zmraženy ve standardním médiu 20% fetální bovinní sérum (FBS) 10% dymethilsulfoxid (DMSO) a skladovány v kapalném dusíku až do použití.

U všech pacientů bude odebrán vzorek jaterní tkáně a část tumoru (T) bude oddělena od části peritumoru (PT). Z T a PT tkáně budou následně izolovány lidské hepatocyty (HC), Kupfferovy buňky (KC), jaterní sinusové endoteliální buňky (LSEC) a lidské hvězdicové buňky (HSC) za sterilních podmínek. Stručně řečeno, jaterní tkáň se umístí do Petriho misky a nařeže se sterilním skalpelem. Poté budou naříznutá játra inkubována v 50ml zkumavce s kolagenázou P (1 mg/ml) při 37 °C po dobu 45 minut. Po inkubaci bude kolagenáza P inaktivována přidáním 20% FBS Hankova balančního solného roztoku (HBSS) a buněčná suspenze bude centrifugována 50 g 5 minut při 4 °C. Supernatant obsahující jaterní neparenchymální buňky (NPC) se shromáždí v nové 50ml zkumavce a peleta se promyje roztokem fosfátového pufru (PBS). HC a NPC budou zmrazeny ve standardním médiu 20% FBS 10% DMSO a skladovány v kapalném dusíku až do použití.

Fragment T a PT bude uložen v roztoku RNAlater při -80 °C. Pro identifikaci CTC budou PBMC rozmraženy, resuspendovány ve standardním médiu a roztříděny pomocí FACSARIA III (BD bioscience) přes EpCAM+, CD47+, CD133+. Bude vyhodnoceno procento jednotlivých pozitivních buněk (EpCAM+, CD47+ a CD133+) a trojnásobně pozitivních buněk (EpCAM/CD47/CD133+++) a bude vypočten celkový počet CTC. CTC budou testovány na jejich replikační a invazivní kapacitu. Pomocí testu buněčné proliferace a invaze vyhodnotíme čas zdvojnásobení CTC (čas potřebný pro zdvojnásobení počtu buněk), rychlost růstu (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= počet buněk v čase t, N(0)= počet buněk v čase 0, t= čas) a rychlost invaze.

Po charakterizaci CTC budeme analyzovat HC a NPC pomocí pozitivních markerů popsaných dříve, abychom vyhodnotili přesnou jaterní derivaci CTC.

Biologický materiál bude odeslán odbornou soukromou dopravou a uložen do laboratoře v "Università degli Studi del Piemonte Orientale".

Vzorce opakování budou vyhodnoceny následovně. Lokální recidiva bude definována jako recidiva na stejném jaterním segmentu v případě parenchyma šetřící resekce nebo na chirurgickém zajištění nejbližších segmentů v případě anatomické resekce. Bude tedy hodnocen počet recidivujících uzlin (jednotné versus mnohočetné), lokalizace recidivy (intrahepatální versus extrahepatální nebo obojí), velikost hlavního recidivujícího uzlu a jaterního segmentu. Všechna tato hodnocení recidivy budou provedena pomocí CT nebo MRI vyšetření během sledování, jak poskytují místní kontrolní protokoly.

Všichni pacienti budou sledováni pomocí lokálního protokolu včetně měření sérového α-FP, celkového bilirubinu, GGT, ALP, albuminu, INR, krevního obrazu, počtu elektrolytů, ultrazvuku, kontrastní počítačové tomografie (CT) nebo magnetické rezonance (MRI). a návštěvy úřadu. Pacienti jsou obvykle kontrolováni každé 3 měsíce během prvního pooperačního roku a poté každých 6 měsíců. Když došlo k recidivě, jsou případy diskutovány v multidisciplinárním prostředí, zahrnujícím radiologa, hepatologa, chirurga, intervenčního radiologa, radioterapeuta a onkologa. Celkové přežití (OS) je definováno jako časový interval (v měsících) od operace do úmrtí pacienta. V případě ztráty pacienta při následném screeningu budou data cenzurována. Přežití bez onemocnění (DFS) je definováno jako časový interval (v měsících) od operace po recidivu nebo smrt. V případě, že nedojde k opakování, budou data cenzurována k datu poslední dostupné kontroly. Tumor-Specific-Survival (TSS) je definován jako časový interval v měsících mezi operací a úmrtím souvisejícím s nádorem.