El papel de las células tumorales circulantes como marcadores de enfermedad avanzada y pronóstico en el CHC

La biopsia líquida puede permitir una mejor estratificación de los pacientes según su pronóstico estimado. También en otros tumores (p. ej. cáncer de mama), la caracterización molecular está permitiendo no sólo comprender mejor las vías patológicas que conducen a la tumorigénesis y progresión, sino también impulsar tratamientos específicos adaptados a la especificidad de la enfermedad del paciente. La biopsia líquida es muy fácil y económica de realizar, ya que consiste en una simple muestra de sangre venosa que será investigada por un clasificador de células para identificar poblaciones específicas de células.

En el carcinoma hepatocelular es común asistir a una elevada tasa de recurrencia: los pacientes que han sido tratados con intención curativa, en el 70% de los casos recaen. En estos casos, los pacientes a menudo tenían una enfermedad hepática inflamatoria subyacente, como cirrosis, que puede impulsar la recaída como factor oncogenético. La cirrosis es un factor de riesgo bien conocido para desarrollar carcinoma hepatocelular en general. Debido a esto, en la práctica clínica es casi difícil distinguir si el nuevo nódulo que hemos diagnosticado debe considerarse como una recurrencia real del primer tumor tratado, o una aparición de novo ligada al impulso de la tumorigénesis subyacente sin cambios, que puede ser eficaz. curado sólo después del trasplante de hígado. Varios estudios retrospectivos ya han demostrado la ventaja, en términos de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia general, de una aparición de novo con respecto a una presentación metastásica real. Sin embargo, nadie ha llegado a ningún marcador clínico o morfológico específico para distinguir entre estas dos condiciones. La caracterización de la naturaleza del nódulo recurrente se ha obtenido únicamente mediante evaluación genética y molecular de la heterogeneidad del tumor. Sin embargo, esta caracterización hoy en día sólo es posible con intención de investigación, y sobre muestra histológica, que podría ser proporcionada sólo después de una eventual decisión de reoperación para tratar la recurrencia considerada. Aún faltan indicaciones sobre cómo tratar la recurrencia del CHC después de la cirugía. Nuestra hipótesis se basa en la teoría de la "semilla y el aceite", que se basa básicamente en la evidencia de la presencia de células tumorales circulantes (CTC) en el torrente sanguíneo. Estas células pueden diseminarse desde los tumores originales como un sello distintivo del cáncer avanzado, que ya ha desarrollado la característica de invasividad. En nuestra opinión, los tumores en una etapa temprana no liberan CTC en el torrente sanguíneo, o no lo hacen con la misma velocidad o calidad, como lo hacen los tumores avanzados. Se considera tumor avanzado aquel que ya presenta invasión microvascular y/o satelitosis, que pueden ser signos histológicos de un estadio avanzado y ya sistémico. Los pacientes con CTC identificadas en la biopsia líquida pueden estar asociados con un peor pronóstico, lo que explica una mayor tasa de recurrencia temprana y recurrencia general, incluso en caso de trasplante. Además, la teoría de la "semilla y el aceite", asociada a la "teoría del realojamiento", puede justificar, desde un punto de vista biooncológico, los casos de recurrencia en el contexto del trasplante, cuando todo el órgano y los factores de riesgo oncogenéticos relativos , se trata por sustitución. Finalmente, desde un punto de vista fisiopatológico, queremos demostrar que los nódulos intrahepáticos (MI) recurrentes se deben a la siembra de células tumorales circulantes, lo que permitirá comprender mejor la carcinogénesis en dichos tumores.

• Objetivo principal: evaluar la asociación entre la variación de las CTC (determinadas en muestras de sangre) y la supervivencia general y la supervivencia libre de enfermedad en pacientes con CHC antes y después de la cirugía (ya sea resección y trasplante).
• Objetivo secundario: evaluar si la identificación positiva de CTC en muestras de sangre se asocia con el patrón de recurrencia metastásica intrahepática tanto en pacientes resecados como en pacientes trasplantados.
• Objetivo terciario: evaluar y monitorear el papel de diferentes variables clínicas, bioquímicas, radiológicas e histopatológicas en la determinación de la recurrencia después de la cirugía y su eventual relación con la presencia y tasa de CTC. La inscripción de pacientes será evaluada por las divisiones quirúrgicas de este estudio. generalmente durante la visita a la clínica ambulatoria antes de la operación quirúrgica. En ese momento los pacientes serán candidatos para este estudio y, si aceptan participar, los investigadores obtendrán el consentimiento por escrito. Los pacientes inscritos serán codificados mediante un número alfanumérico para preservar la identidad. Los investigadores que trabajarán en el laboratorio donde se analizarán las CTC no podrán rastrear al propietario de la muestra y no tendrán acceso a los datos clínicos (análisis ciego).

Antes de la cirugía de cada paciente, se recolectará una biopsia líquida de sangre periférica (al mismo tiempo que el análisis de sangre de rutina). Las muestras se utilizarán para analizar la tasa y el tipo de CTC mediante FACSARIA III (BD bioscience). Durante la cirugía, un patólogo experto recolectará una porción nueva del tumor y del hígado casi sano, quien utilizará las secciones para la evaluación histológica habitual según lo dispuesto por las mejores prácticas clínicas y las pautas internacionales. Las secciones restantes se mantendrán en hielo durante el envío a la unidad de laboratorio. Los investigadores realizarán el aislamiento y almacenamiento de células hepáticas vivas en condiciones estériles. Luego, las células hepáticas se analizarán con FACSARIA III y se utilizarán para más experimentos in vitro.

La biopsia líquida se realizará nuevamente al día 30 del postoperatorio durante la primera visita ambulatoria, y luego cada seis meses, de acuerdo y en paralelo con los protocolos de seguimiento locales. La biopsia líquida realizada durante el seguimiento se gestionará como la preoperatoria, durante las pruebas habituales previstas para fines clínicos. El seguimiento se cerrará a los 30 meses.

Todas las operaciones serán realizadas por cirujanos con amplia experiencia en cirugía hepática. La técnica de resección será la preferencia del cirujano, según el protocolo local, las buenas prácticas clínicas y las directrices nacionales. Todos los cirujanos adoptaron los mismos criterios para seleccionar la estrategia quirúrgica: variables basales de función hepática, localización y diámetro del tumor y número de nódulos. Se realizará una ecografía (EE. UU.) de reestadificación intraoperatoriamente para cada paciente. Después de la extirpación del tumor, un patólogo involucrado en este estudio tomará una muestra del tumor para obtener una sección recién congelada del tumor, con el tejido hepático sano relacionado, para almacenarlo para análisis posteriores. Esta muestra debe realizarse de acuerdo con lineamientos internacionales y convenios éticos locales, y siempre debe garantizar el material correcto para realizar el diagnóstico histológico. Si el tejido extraído del paciente inscrito en este estudio no permite realizar la muestra para el estudio sin afectar el diagnóstico histológico óptimo, el paciente será excluido del estudio y no se ejecutará ningún muestreo.

Para todos los pacientes, se recolectarán 20 ml de muestra de sangre en ayunas en un tubo de vacío estéril. La recolección se realizará al mismo tiempo que las muestras de sangre preoperatorias de rutina o los controles de seguimiento planificados, ya que no se debe proporcionar ningún otro procedimiento invasivo a los pacientes desde su inscripción en el estudio. La muestra de sangre se almacenará a 4 ° C y se manipulará en un plazo de 6 horas. Luego, se centrifugarán 5 ml a 3000 rpm durante 10 minutos a 4 °C, la fase de plasma se recolectará y se dividirá en alícuotas en tubos estériles de 1,5 ml y se almacenará a -80 °C hasta su uso o envío. Luego, aislaremos las células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) mediante gradiente de Ficoll de los 15 ml restantes. Después del aislamiento, las PBMC vivas se congelarán en medios estándar con un 20% de suero bovino fetal (FBS) y un 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se almacenarán en nitrógeno líquido hasta su uso.

Para todos los pacientes, se recolectará una muestra de tejido hepático y la porción tumoral (T) se separará de la porción peritumoral (PT). En consecuencia, del tejido T y PT se aislarán hepatocitos humanos (HC), células de Kupffer (KC), células endoteliales sinusoidales del hígado (LSEC) y células estrelladas humanas (HSC) en condiciones estériles. Brevemente, se colocará tejido hepático en una placa de Petri y se cortará con un bisturí estéril. Luego, el hígado cortado se incubará en un tubo de 50 ml con colagenasa P (1 mg/ml) a 37 °C durante 45 minutos. Después de la incubación, la colagenasa P se inactivará añadiendo una solución salina de equilibrio de Hank (HBSS) FBS al 20 % y la suspensión celular se centrifugará 50 g durante 5 minutos a 4 °C. El sobrenadante, que contiene células no parenquimatosas (NPC) del hígado, se recogerá en un tubo nuevo de 50 ml y el sedimento se lavará con solución tampón fosfato (PBS). HC y NPC se congelarán en medios estándar con 20% de FBS y 10% de DMSO y se almacenarán en nitrógeno líquido hasta su uso.

Se almacenará un fragmento de T y PT en una solución de RNAlater a -80 °C. Para la identificación de CTC, las PBMC se descongelarán, se resuspendirán en medios estándar y se clasificarán con FACSARIA III (BD bioscience) a través de EpCAM+, CD47+, CD133+. Se evaluará el porcentaje de células positivas únicas (EpCAM+, CD47+ y CD133+) y triple positivas (EpCAM/CD47/CD133+++) y se calculará el número total de CTC. Se probará la capacidad replicativa e invasiva de las CTC. Utilizando el ensayo de proliferación e invasión celular, evaluaremos el tiempo de duplicación de CTC (tiempo necesario para que las células dupliquen su número), la tasa de crecimiento (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= el número de células en el momento t, N(0)= el número de células en el momento 0, t= tiempo) y la tasa de invasión.

Después de la caracterización de CTC analizaremos HC y NPC, utilizando los marcadores positivos descritos previamente, para evaluar la derivación hepática exacta de CTC.

El material biológico será enviado mediante transporte privado experto y almacenado en el laboratorio de la "Università degli Studi del Piemonte Orientale".

Los patrones de recurrencia se evaluarán de la siguiente manera. La recurrencia local se definirá como una recurrencia en el mismo segmento hepático en caso de resección preservadora del parénquima, o en la cobertura quirúrgica de los segmentos más cercanos en caso de resección anatómica. Así, se evaluará el número de nódulos recurrentes (simples versus múltiples), la ubicación de la recurrencia (intrahepática versus extrahepática o ambas), el tamaño del nódulo recurrente principal y el segmento hepático. Todas estas evaluaciones de recurrencia se realizarán mediante tomografía computarizada o resonancia magnética durante el seguimiento, según lo establecen los protocolos de seguimiento locales.

Todos los pacientes serán seguidos utilizando un protocolo local que incluye medición de α-FP sérica, bilirrubina total, GGT, ALP, albúmina, INR, hemograma, recuento de electrolitos, ultrasonido, tomografía computarizada (CT) de contraste o imágenes por resonancia magnética (MRI). y visitas al consultorio. Por lo general, los pacientes son examinados cada 3 meses durante el primer año posoperatorio y cada 6 meses posteriormente. Cuando ocurre la recurrencia, los casos se discuten en un ambiente multidisciplinario, involucrando a radiólogo, hepatólogo, cirujano, radiólogo intervencionista, radioterapeuta y oncólogo. La supervivencia general (OS) se define como el intervalo de tiempo (en meses) desde la cirugía hasta la muerte del paciente. Los datos serán censurados en caso de que el paciente pierda su control en el control de seguimiento. La supervivencia libre de enfermedad (SSE) se define como el intervalo de tiempo (en meses) desde la cirugía hasta la recurrencia o la muerte. En caso de no recurrencia, los datos serán censurados en la fecha del último seguimiento disponible. La supervivencia específica del tumor (TSS) se define como el intervalo de tiempo en meses entre la cirugía y la muerte relacionada con el tumor.