Роль циркулирующих опухолевых клеток как маркеров прогрессирующего заболевания и прогноза при ГЦК

Жидкостная биопсия может позволить лучше стратифицировать пациентов в соответствии с их предполагаемым прогнозом. А также при других опухолях (например, рак молочной железы), молекулярная характеристика позволяет не только лучше понять патологические пути, которые приводят к возникновению и прогрессированию опухолей, но и разработать конкретные методы лечения, адаптированные к специфике заболевания пациента. Жидкостную биопсию очень легко и дешево выполнить, поскольку она состоит из простого образца венозной крови, который будет исследован сортировщиком клеток для идентификации конкретных популяций клеток.

При гепатоцеллюлярной карциноме нередко наблюдается повышенная частота рецидивов: у больных, лечившихся с лечебной целью, в 70% случаев наблюдается рецидив. В этих случаях у пациентов часто наблюдалось воспалительное заболевание печени, такое как цирроз печени, которое может стать причиной рецидива как онкогенетического фактора. Цирроз печени является хорошо известным фактором риска развития гепатоцеллюлярной карциномы в целом. Из-за этого в клинической практике почти трудно отличить, следует ли рассматривать новый диагностированный нами узел как реальный рецидив первой пролеченной опухоли или как возникновение de novo, связанное с неизмененным основным усилением онкогенеза, которое может быть эффективно устранено. излечивается только после трансплантации печени. Несколько ретроспективных исследований уже продемонстрировали преимущество с точки зрения безрецидивной и общей выживаемости возникновения de novo по сравнению с реальными метастатическими проявлениями. Однако никому не удалось достичь каких-либо конкретных клинических или морфологических маркеров, позволяющих различать эти два состояния. Характеристика природы рецидивного узла была получена только путем генетической и молекулярной оценки гетерогенности опухоли. Тем не менее, такая характеристика в настоящее время возможна только в исследовательских целях и на гистологическом образце, который может быть предоставлен только после окончательного решения о повторной операции для лечения рассматриваемого рецидива. Показания к лечению рецидива ГЦК после операции до сих пор отсутствуют. Наша гипотеза основана на теории «семени и масла», которая в основном основана на доказательствах присутствия циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в кровотоке. Эти клетки могут распространяться из исходных опухолей, что является признаком прогрессирующего рака, который уже развил характеристики инвазивности. По нашему мнению, опухоли на ранней стадии не выделяют ЦОК в кровоток или не выделяют их в той же степени и качестве, что и развитые опухоли. Мы считали распространенной опухолью ту, которая уже может иметь микрососудистую инвазию и/или сателлитоз, что может быть гистологическими признаками развитой и уже системной стадии. Пациенты с ЦОК, выявленными при жидкой биопсии, могут иметь худший прогноз, что приводит к увеличению частоты ранних рецидивов и общего рецидива, даже в случае трансплантации. Кроме того, теория «семени и масла», связанная с «теорией переселения», может с биоонкологической точки зрения оправдать случаи рецидива в условиях трансплантации, когда весь орган и относительные онкогенетические факторы риска , лечится заменой. Наконец, с патофизиологической точки зрения мы хотим продемонстрировать, что рецидивирующие внутрипеченочные узелки (ИМ) возникают в результате посева циркулирующих опухолевых клеток, что позволит лучше понять канцерогенез в этих опухолях.

• Основная цель: оценить связь между вариациями ЦОК, определяемыми в образцах крови, и общей выживаемостью и безрецидивной выживаемостью у пациентов с ГЦК до и после операции (резекции или трансплантации).
• Вторичная цель: оценить, связана ли положительная идентификация ЦОК в образцах крови с внутрипеченочным метастатическим паттерном рецидивов как у удаленных пациентов, так и у трансплантированных.
• Третичная цель: оценить и контролировать роль различных клинических, биохимических, радиологических и гистопатологических переменных в определении рецидива после операции и их возможной связи с наличием и частотой ЦОК. Набор пациентов будет оцениваться хирургическими подразделениями этого исследования. обычно во время посещения поликлиники перед хирургической операцией. В этот момент пациенты станут кандидатами на участие в этом исследовании, и, если они согласятся на участие, исследователи получат письменное согласие. Зарегистрированные пациенты будут кодироваться буквенно-цифровым номером для сохранения идентичности. Исследователи, которые будут работать в лаборатории, где будут анализироваться ЦОК, не смогут отследить владельца образца и не будут иметь доступа к клиническим данным (слепой анализ).

Перед операцией у каждого пациента берут жидкую биопсию периферической крови (одновременно с обычным анализом крови). Образцы будут использоваться для анализа количества и типа ЦОК с помощью FACSARIA III (BD bioscience). Во время операции эксперт-патологоанатом возьмет свежий срез опухоли и почти здоровой печени, который будет использовать срезы для обычной гистологической оценки, как это предусмотрено лучшей клинической практикой и международными рекомендациями. Остальные секции будут храниться на льду во время транспортировки в лабораторный блок. Исследователи проведут изоляцию и хранение живых клеток печени в стерильных условиях. Затем клетки печени будут проанализированы с помощью FACSARIA III и использованы для дальнейших экспериментов in vitro.

Жидкостная биопсия будет проводиться повторно на 30-й день после операции во время первого амбулаторного визита, а затем каждые шесть месяцев в соответствии и параллельно с местными протоколами наблюдения. Жидкостная биопсия, выполняемая во время последующего наблюдения, будет рассматриваться как предоперационная, во время обычных тестов, предусмотренных для клинических целей. Последующее наблюдение завершится через 30 месяцев.

Все операции будут выполнять хирурги с большим опытом работы в хирургии печени. Техника резекции будет выбираться по усмотрению хирурга в соответствии с местным протоколом, надлежащей клинической практикой и национальными рекомендациями. Все хирурги использовали одни и те же критерии для выбора хирургической стратегии: исходные параметры функции печени, расположение и диаметр опухоли, а также количество узлов. Повторное УЗИ (УЗИ) будет проводиться интраоперационно каждому пациенту. После удаления опухоли патологоанатом, участвующий в этом исследовании, возьмет образец опухоли, чтобы получить свежезамороженный срез опухоли вместе с соответствующей здоровой тканью печени и сохранить его для дальнейшего анализа. Этот образец должен быть взят в соответствии с международными рекомендациями и местным этическим соглашением, и он всегда должен гарантировать правильный материал для постановки гистологического диагноза. Если ткань, удаленная у пациента, включенного в это исследование, не позволяет взять образец для исследования, не влияя на оптимальный гистологический диагноз, пациент будет исключен из исследования, и отбор проб не будет выполняться.

У всех пациентов 20 мл образца крови натощак будут собраны в стерильную вакуумную пробирку. Сбор будет проводиться одновременно с обычными предоперационными образцами крови или плановыми последующими контролями, поскольку с момента их включения в исследование пациентам не следует проводить никакие другие инвазивные процедуры. Образец крови будет храниться при температуре 4°C и обрабатываться в течение 6 часов. Затем 5 мл центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут при 4°C, фазу плазмы собирают и разливают в стерильные пробирки емкостью 1,5 мл и хранят при -80°C до использования или отправки. Затем мы изолируем мононуклеатные клетки периферической крови (PBMC) через градиент фиколла из оставшихся 15 мл. После выделения живые РВМС замораживают в стандартной среде: 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и хранят в жидком азоте до использования.

У всех пациентов будет взят образец ткани печени, и часть опухоли (Т) будет отделена от части перитумора (ПТ). Из тканей Т и PT будут последовательно выделены гепатоциты человека (HC), клетки Купфера (KC), синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSEC) и звездчатые клетки человека (HSC) в стерильных условиях. Вкратце, ткань печени помещают в чашку Петри и разрезают стерильным скальпелем. Затем разрезанную печень инкубируют в пробирке емкостью 50 мл с коллагеназой P (1 мг/мл) при 37°C в течение 45 минут. После инкубации коллагеназу P инактивируют добавлением 20% FBS сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), а клеточную суспензию центрифугируют при 50 г в течение 5 минут при 4°C. Супернатант, содержащий непаренхиматозные клетки печени (NPC), собирают в новую пробирку емкостью 50 мл, а осадок промывают раствором фосфатного буфера (PBS). HC и NPC будут заморожены в стандартных средах (20% FBS, 10% ДМСО) и храниться в жидком азоте до использования.

Фрагмент Т и ПТ будут храниться в растворе РНК позже при -80°С. Для идентификации ЦОК РВМС размораживают, ресуспендируют в стандартной среде и сортируют с помощью FACSARIA III (BD bioscience) через EpCAM+, CD47+, CD133+. Будет оценен процент одиночных положительных клеток (EpCAM+, CD47+ и CD133+) и тройных положительных клеток (EpCAM/CD47/CD133+++) и рассчитано общее количество ЦОК. КТЦ будут проверены на предмет их репликативной и инвазивной способности. Используя анализ клеточной пролиферации и инвазии, мы оценим время удвоения CTC (время, необходимое для удвоения числа клеток), скорость роста (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= количество клеток в момент времени t, N(0) = количество клеток в момент времени 0, t = время) и скорость инвазии.

После характеристики ЦОК мы проанализируем HC и NPC, используя ранее описанные положительные маркеры, чтобы оценить точное печеночное происхождение ЦОК.

Биологический материал будет доставлен на специализированном частном транспорте и храниться в лаборатории «Università degli Studi del Piemonte Orientale».

Шаблоны повторения будут оцениваться следующим образом. Локальный рецидив будет определяться как рецидив на том же сегменте печени в случае резекции с сохранением паренхимы или на хирургическом границе ближайших сегментов в случае анатомической резекции. Таким образом, будет оценено количество рецидивирующих узелков (одиночный или множественный), локализация рецидива (внутрипеченочный или внепеченочный или оба), размер основного рецидивирующего узла и сегмента печени. Все эти оценки рецидива будут проводиться с помощью КТ или МРТ во время наблюдения, как это предусмотрено местными протоколами наблюдения.

За всеми пациентами будут наблюдать с использованием местного протокола, включая измерение сывороточного альфа-ФП, общего билирубина, ГГТ, ЩФ, альбумина, МНО, анализ крови, количество электролитов, УЗИ, контрастную компьютерную томографию (КТ) или магнитно-резонансную томографию (МРТ). и визиты в офис. Пациентов обычно проверяют каждые 3 месяца в течение первого года после операции и каждые 6 месяцев в дальнейшем. При возникновении рецидива случаи обсуждаются в мультидисциплинарной обстановке с участием радиолога, гепатолога, хирурга, интервенционного радиолога, радиотерапевта и онколога. Общая выживаемость (ОВ) определяется как интервал времени (в месяцах) от операции до смерти пациента. Данные будут подвергнуты цензуре в случае выпадения пациента при последующем обследовании. Выживаемость без заболеваний (DFS) определяется как временной интервал (в месяцах) от операции до рецидива или смерти. В случае отсутствия рецидива данные будут подвергнуты цензуре на дату последнего доступного наблюдения. Опухоспецифическая выживаемость (TSS) определяется как временной интервал в месяцах между операцией и смертью, связанной с опухолью.