Kiertävien kasvainsolujen rooli pitkälle edenneiden sairauksien ja ennusteen merkkinä HCC:ssä

Nestebiopsia voi mahdollistaa potilaiden paremman kerrostumisen heidän arvioidun ennusteensa mukaan. Samoin muissa kasvaimissa (esim. rintasyöpä), molekyylien karakterisointi mahdollistaa paitsi tuumorin muodostumiseen ja etenemiseen johtavien patologisten teiden ymmärtämisen paremmin, myös potilaan sairauden spesifisyyteen räätälöityjen spesifisten hoitojen ohjaamisen. Nestebiopsia on erittäin helppo ja halpa suorittaa, koska se koostuu yksinkertaisesta laskimoverinäytteestä, jonka solulajittelija tutkii tiettyjen solupopulaatioiden tunnistamiseksi.

Maksasellulaarisessa karsinoomassa se on yleinen auttamaan kohonneessa uusiutumisprosentissa: potilaat, joita on hoidettu parantavalla tarkoituksella, 70 prosentissa tapauksista uusiutuvat. Näissä tapauksissa potilailla oli usein taustalla oleva tulehduksellinen maksasairaus, kuten kirroosi, joka voi aiheuttaa pahenemisen onkogeneettisenä tekijänä. Kirroosi on yleisesti tunnettu riskitekijä hepatosellulaarisen karsinooman kehittymiselle. Tästä johtuen kliinisessä käytännössä on lähes vaikea erottaa, pitäisikö diagnosoitua uutta kyhmyä pitää ensimmäisenä hoidetun kasvaimen todellisena uusiutuneena vai de novo -tapauksena, joka liittyy muuttumattomaan taustalla olevaan kasvaimen muodostukseen, mikä voi olla tehokasta. parantuu vasta maksansiirron jälkeen. Useat retrospektiiviset tutkimukset osoittivat jo de novo -esiintymisen edun todelliseen metastaattiseen esitykseen verrattuna taudista vapaan eloonjäämisen ja kokonaiseloonjäämisen kannalta. Kukaan ei kuitenkaan ole saavuttanut erityisiä kliinisiä tai morfologisia markkereita näiden kahden tilan erottamiseksi. Toistuvan kyhmyn luonteen karakterisointi on saatu vain kasvainten heterogeenisyyden geneettisellä ja molekyylisellä arvioinnilla. Kuitenkin tämä karakterisointi on nykyään mahdollista vain tutkimustarkoituksessa ja histologisella näytteellä, joka voidaan antaa vasta mahdollisen uusintaleikkauspäätöksen jälkeen harkitun uusiutumisen hoitamiseksi. Ohjeita HCC:n uusiutumisen hoitoon leikkauksen jälkeen puuttuu edelleen. Hypoteesimme perustuu "siemenen ja öljyn" teoriaan, joka perustuu pohjimmiltaan todisteisiin kiertävien kasvainsolujen (CTC) läsnäolosta verenkierrossa. Nämä solut voivat levitä alkuperäisistä kasvaimista tunnusmerkkinä kehittyneelle syövälle, jolle on jo kehittynyt invasiivisuusominaisuus. Olemme sitä mieltä, että varhaisessa vaiheessa olevat kasvaimet eivät vapauta CTC:itä verenkiertoon tai ne eivät vapauta samalla nopeudella tai laadulla kuin pitkälle edennyt kasvain. Pidimme edenneenä kasvaimena sitä, jolla saattaa olla jo mikrovaskulaarinen invaasio ja/tai satellitoosi, mikä saattaa olla edenneen ja jo systeemisen vaiheen histologisia merkkejä. Potilaiden, joilla on nestemäisessä biopsiassa havaitut CTC:t, ennuste saattaa heikentyä, mikä lisää varhaista uusiutumista ja yleistä uusiutumista, jopa elinsiirron tapauksessa. Lisäksi "siementen ja öljyjen" teoria, joka liittyy "rehoming-teoriaan", voi oikeuttaa bioonkologisesta näkökulmasta tapaukset, joissa uusiutuminen tapahtuu elinsiirtoympäristössä, kun koko elin ja suhteelliset onkogeneettiset riskitekijät. , käsitellään korvaamalla. Lopuksi, patofysiologisesta näkökulmasta, haluamme osoittaa, että toistuvat maksansisäiset kyhmyt (IM) johtuvat kiertävien kasvainsolujen siirrosta, mikä mahdollistaa näiden kasvainten karsinogeneesin paremman ymmärtämisen.

• Ensisijainen tavoite: arvioida verinäytteestä määritettyjen CTC-arvojen vaihtelun ja HCC-potilaiden kokonaiseloonjäämisen ja taudista vapaan eloonjäämisen välinen yhteys ennen ja jälkeen leikkausta (joko resektio ja transplantaatio).
• Toissijainen tavoite: arvioida, liittyykö CTC:iden positiivinen tunnistaminen verinäytteissä maksansisäiseen metastaattiseen uusiutumismalliin joko resektoiduilla ja siirretyillä potilailla.
• Kolmannen asteen tavoite: arvioida ja seurata eri kliinisten, biokemiallisten, radiologisten ja histopatologisten muuttujien roolia määritettäessä uusiutumista leikkauksen jälkeen ja niiden mahdollista suhdetta CTC:iden esiintymiseen ja määrään. Tämän tutkimuksen kirurgiset osastot arvioivat potilaiden ilmoittautumista, yleensä poliklinikkakäynnin aikana ennen leikkausta. Tällä hetkellä potilaat ovat ehdokkaita tähän tutkimukseen, ja jos he suostuvat osallistumaan, tutkijat saavat kirjallisen suostumuksen. Ilmoittautuneet potilaat koodataan aakkosnumeerisella numerolla henkilöllisyyden säilyttämiseksi. Tutkijat, jotka työskentelevät laboratoriossa, jossa CTC:t analysoidaan, eivät pysty jäljittämään näytteen omistajaa, eivätkä heillä ole pääsyä kliinisiin tietoihin (sokkoanalyysi).

Ennen leikkausta jokaisesta potilaasta otetaan nestemäinen biopsia ääreisverestä (samaan aikaan rutiiniverianalyysin kanssa). Näytteitä käytetään CTC:n nopeuden ja tyypin analysointiin FACSARIA III:lla (BD bioscience). Leikkauksen aikana asiantuntijapatologi kerää tuoreen siivun kasvaimesta ja lähes terveestä maksasta, joka käyttää leikkeitä tavanomaiseen histologiseen arviointiin parhaan kliinisen käytännön ja kansainvälisten ohjeiden mukaisesti. Loput osat pidetään jäissä laboratorioyksikköön kuljetuksen aikana. Tutkijat suorittavat elävien maksasolujen eristämisen ja varastoinnin steriileissä olosuhteissa. Sitten maksasolut analysoidaan FACSARIA III:lla ja niitä käytetään muihin in vitro -kokeisiin.

Nestebiopsia suoritetaan uudelleen 30. leikkauksen jälkeisenä päivänä ensimmäisen avohoitokäynnin aikana ja sen jälkeen kuuden kuukauden välein paikallisten seurantakäytäntöjen mukaisesti ja niiden kanssa samanaikaisesti. Seurannan aikana tehty nestebiopsia hoidetaan ennen leikkausta, normaalien kliiniseen tarkoitukseen tarkoitettujen testien aikana. Seuranta päättyy 30 kuukauden kuluttua.

Kaikki leikkaukset tekevät kirurgit, joilla on pitkä kokemus maksakirurgiasta. Resektiotekniikka on kirurgin mieltymys paikallisen protokollan, hyvän kliinisen käytännön ja kansallisten ohjeiden mukaisesti. Kaikki kirurgit omaksuivat samat kriteerit valitakseen kirurgisen strategian: maksan toiminnan lähtötilanteen muuttujat, kasvaimen sijainti ja halkaisija sekä kyhmyjen lukumäärä. Restaging Ultrasonography (US) suoritetaan intraoperatiivisesti jokaiselle potilaalle. Kasvaimen poiston jälkeen tähän tutkimukseen osallistuva patologi ottaa näytteen kasvaimesta saadakseen tuoreen jäädytetyn osan kasvaimesta ja siihen liittyvästä terveestä maksakudoksesta, jotta se säilytetään jatkoanalyysiä varten. Tämä näyte tulee tehdä kansainvälisten ohjeiden ja paikallisen eettisen sopimuksen mukaisesti, ja sen tulee aina taata oikea materiaali histologisen diagnoosin suorittamiseen. Jos tähän tutkimukseen osallistuneesta potilaasta poistettu kudos ei salli näytteen ottamista tutkimukseen vaikuttamatta optimaaliseen histologiseen diagnoosiin, potilas suljetaan pois tutkimuksesta eikä näytteenottoa suoriteta.

Kaikilta potilailta otetaan 20 ml paastoverinäyte steriiliin tyhjiöputkeen. Keräys tehdään samaan aikaan rutiininomaisten preoperatiivisten verinäytteiden tai suunniteltujen seurantakontrollien kanssa, koska muita invasiivisia toimenpiteitä ei tule tarjota potilaille heidän tutkimukseen ilmoittautumisen jälkeen. Verinäyte säilytetään 4°C:ssa ja käsitellään 6 tunnin kuluessa. Sitten 5 ml sentrifugoidaan nopeudella 3000 rpm 10 minuuttia 4 °C:ssa, plasmafaasi kerätään ja jaetaan eriin 1,5 ml:n steriileihin putkiin ja säilytetään -80 °C:ssa käyttöön tai toimitukseen asti. Sitten eristamme perifeerisen veren mononukleaattisolut (PBMC) Ficoll-gradientin kautta jäljellä olevista 15 ml:sta. Eristämisen jälkeen elävät PBMC:t jäädytetään standardiväliaineessa, jossa on 20 % Fetal Bovin Serum (FBS) 10 % Dymethil Sulfoxide (DMSO) ja säilytetään nestetypessä käyttöön asti.

Kaikilta potilailta kerätään maksakudosnäyte ja kasvain (T) osa erotetaan peritumor (PT) osasta. T- ja PT-kudosta eristetään peräkkäin ihmisen hepatosyytit (HC), Kupffer-solut (KC), maksan sinusoidiset endoteelisolut (LSEC) ja ihmisen tähtisolut (HSC) steriileissä olosuhteissa. Lyhyesti sanottuna maksakudos asetetaan petrimaljaan ja leikataan steriilillä skalpellilla. Sitten leikattua maksaa inkuboidaan 50 ml:n putkessa kollagenaasi P:n (1 mg/ml) kanssa 37 °C:ssa 45 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen kollagenaasi P inaktivoidaan lisäämällä 20 % FBS Hank's Balance Salt -liuosta (HBSS) ja solususpensiota sentrifugoidaan 50 g 5 minuuttia 4 °C:ssa. Supernatantti, joka sisältää maksan ei-parenkymaalisia soluja (NPC), kerätään uuteen 50 ml:n putkeen ja pelletti pestään fosfaattipuskuriliuoksella (PBS). HC ja NPC pakastetaan standardiväliaineessa 20 % FBS 10 % DMSO ja säilytetään nestetypessä käyttöön asti.

T:n ja PT:n fragmentti säilytetään RNAlater-liuoksessa -80 °C:ssa. CTC:n tunnistamista varten PBMC sulatetaan, suspendoidaan uudelleen standardiväliaineeseen ja lajitellaan FACSARIA III:lla (BD bioscience) EpCAM+:n, CD47+:n, CD133+:n kautta. Yksittäisten positiivisten solujen (EpCAM+, CD47+ ja CD133+) ja kolminkertaisesti positiivisten solujen (EpCAM/CD47/CD133+++) prosenttiosuus arvioidaan ja kokonais-CTC-luku lasketaan. CTC:t testataan niiden replikatiivisen ja invasiivisen kapasiteetin suhteen. Soluproliferaatio- ja invaasiomääritystä käyttämällä arvioimme CTC:n kaksinkertaistumisajan (aika, joka tarvitaan solujen lukumäärän kaksinkertaistumiseen), kasvunopeutta (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)=) solujen lukumäärä hetkellä t, N(0) = solujen lukumäärä hetkellä 0, t = aika) ja tunkeutumisnopeus.

CTC-karakterisoinnin jälkeen analysoimme HC:tä ja NPC:tä käyttämällä aiemmin kuvattuja positiivisia markkereita, jotta voimme arvioida tarkan CTC-maksajohdannaisen.

Biologinen materiaali kuljetetaan asiantuntevalla yksityisellä kuljetuksella ja varastoidaan "Università degli Studi del Piemonte Orientalen" laboratorioon.

Toistumismallit arvioidaan seuraavasti. Paikallinen uusiutuminen määritellään uusiutumiseksi samassa maksasegmentissä parenchyma sparing -resektiossa tai lähimpien segmenttien kirurgisessa suojauksessa anatomisen resektion tapauksessa. Siten arvioidaan toistuvien kyhmyjen lukumäärä (yksi vs. useita), uusiutumisen sijainti (intrahepaattinen vs. ekstrahepaattinen tai molemmat), pääasiallisen toistuvan kyhmyn koko ja maksasegmentti. Kaikki nämä uusiutumisen arvioinnit tehdään CT-skannauksella tai MRI-skannauksella seurannan aikana, kuten paikalliset seurantaprotokollat ​​tarjoavat.

Kaikkia potilaita seurataan käyttämällä paikallista protokollaa, joka sisältää seerumin α-FP:n, kokonaisbilirubiinin, GGT:n, ALP:n, albumiinin, INR:n, verenkuvan, elektrolyyttimäärän, ultraäänen, kontrastitietokonetomografian (CT) tai magneettiresonanssikuvauksen (MRI) mittauksen. ja toimistovierailuja. Potilaat tarkastetaan yleensä 3 kuukauden välein ensimmäisen leikkauksen jälkeisen vuoden aikana ja sen jälkeen 6 kuukauden välein. Kun uusiutuminen tapahtui, tapauksista keskustellaan monitieteisessä ympäristössä, johon osallistuvat radiologi, hepatologi, kirurgi, interventioradiologi, sädeterapeutti ja onkologi. Overall-Survival (OS) määritellään aikaväliksi (kuukausina) leikkauksesta potilaan kuolemaan. Tiedot sensuroidaan, jos potilas on irronnut seurantaseulonnassa. Disease-Free Survival (DFS) määritellään ajanjaksoksi (kuukausina) leikkauksesta uusiutumiseen tai kuolemaan. Jos tiedot eivät toistu, tiedot sensuroidaan viimeisen saatavilla olevan seurantapäivän päivänä. Kasvainspesifinen eloonjääminen (TSS) määritellään ajanjaksoksi kuukausina leikkauksen ja kasvaimeen liittyvän kuoleman välillä.