Rollen til sirkulerende tumorceller som markører for avansert sykdom og prognose i HCC

Væskebiopsi kan tillate en bedre stratifisering av pasienter i henhold til deres estimerte prognose. I tillegg til andre svulster (f.eks. brystkreft), tillater molekylær karakterisering ikke bare å bedre forstå de patologiske veiene som fører til tumorgenese og progresjon, men også å drive spesifikke behandlinger skreddersydd etter spesifisiteten til pasientsykdommen. Flytende biopsi er veldig enkelt og billig å utføre, siden det består av en enkel venøs blodprøve som vil bli undersøkt av cellesorterer for å identifisere spesifikke cellepopulasjoner.

I hepatocellulært karsinom er det vanlig å hjelpe på en forhøyet residivrate: pasienter som har blitt behandlet med en kurativ hensikt, i 70% av tilfellene tilbakefall. I disse tilfellene hadde pasientene ofte en underliggende inflammatorisk leversykdom, som skrumplever, som kan drive tilbakefallet som en onkogenetisk faktor. Skrumplever er en velkjent risikofaktor for å utvikle hepatocellulært karsinom generelt. På grunn av dette er det i klinisk praksis nesten vanskelig å skille om den nye knuten vi har diagnostisert skal betraktes som et reelt tilbakefall av den først behandlede svulsten, eller en de-novo-forekomst knyttet til den uendrede underliggende tumorgenese-boosten, som kan være effektivt helbredes først etter levertransplantasjon. Flere retrospektive studier har allerede vist fordelen, når det gjelder sykdomsfri overlevelse og total overlevelse, ved en de-novo-forekomst i forhold til en reell metastatisk presentasjon. Imidlertid har ingen nådd noen spesifikke kliniske eller morfologiske markører for å skille mellom disse to tilstandene. Karakterisering av naturen til den tilbakevendende knuten er kun oppnådd ved genetisk og molekylær evaluering av svulstenes heterogenitet. Ikke desto mindre er denne karakteriseringen i dag bare mulig med forskningshensikt, og på histologiske prøver, som kun kan gis etter en eventuell beslutning om ny kirurgi for å behandle det betraktede residiv. Indikasjon på hvordan man behandler HCC-residiv etter operasjon mangler fortsatt. Vår hypotese er basert på "frø og olje"-teorien, som i utgangspunktet er basert på bevis på tilstedeværelsen av sirkulerende tumorceller (CTC) i blodstrømmen. Disse cellene kan spres fra de opprinnelige svulstene som et kjennetegn på fremskreden kreft, som allerede har utviklet invasivitetskarakteristikken. Det er vår oppfatning at svulster i et tidlig stadium ikke frigjør, eller ikke i samme hastighet eller kvalitet, CTC i blodet som avansert svulst gjør. Vi vurderte en avansert svulst, den som allerede har mikrovaskulær invasjon og/eller satellitose, som kan være histologiske tegn på et avansert og allerede systemisk stadium. Pasienter med CTC-er identifisert ved flytende biopsi kan være assosiert med en forverret prognose, noe som utgjør en økt forekomst av tidlig residiv og totalt residiv, selv ved transplantasjon. I tillegg kan "frø og olje"-teorien, assosiert med "rehoming-teorien" rettferdiggjøre, fra et bio-onkologisk synspunkt, tilfeller av tilbakefall i transplantasjonsmiljøet, når hele organet, og de relative onkogenetiske risikofaktorene , behandles ved substitusjon. Til slutt, fra et patofysiologisk synspunkt, ønsker vi å demonstrere at tilbakevendende intrahepatiske knuter (IM) skyldes sirkulerende tumorcellers såing, noe som tillater en bedre forståelse av karsinogenese i disse svulstene.

• Primært mål: å evaluere sammenhengen mellom variasjon i CTC - bestemt i blodprøver - og total overlevelse og sykdomsfri overlevelse hos HCC-pasienter før og etter operasjon (enten reseksjon og transplantasjon).
• Sekundært mål: å evaluere om den positive identifiseringen av CTC i blodprøver er assosiert med det intra-hepatiske metastatiske mønsteret av tilbakefall hos enten resekerte pasienter og transplanterte.
• Tertiært mål: å evaluere og overvåke rollen til ulike kliniske, biokjemiske, radiologiske og histopatologiske variabler i å bestemme tilbakefall etter operasjon og deres eventuelle sammenheng med tilstedeværelsen og frekvensen av CTCs. Pasientregistrering vil bli vurdert av de kirurgiske avdelingene i denne studien, vanligvis under poliklinikkbesøket før den kirurgiske operasjonen. I det øyeblikket vil pasienter være kandidater for denne studien, og hvis de aksepterer å delta, vil forskerne få skriftlig samtykke. Registrerte pasienter vil bli kodifisert med et alfanumerisk nummer for å bevare identiteten. Forskere som skal ansettes i laboratoriet hvor CTC-ene skal analyseres, vil ikke kunne spore eieren av prøven, og de vil ikke ha tilgang til de kliniske dataene (blindanalyse).

Før operasjonen for hver pasient vil flytende biopsi fra perifert blod bli samlet inn (i samme tid med rutinemessig blodanalyse). Prøver vil bli brukt til å analysere CTCs rate og type ved FACSARIA III (BD biovitenskap). Under operasjonen vil en fersk skive av svulsten og lever nær helse bli samlet inn av en ekspert patolog, som vil bruke seksjon(er) for den vanlige histologiske evalueringen som gitt av beste klinisk praksis og internasjonale retningslinjer. De resterende seksjonene vil bli holdt på is under forsendelse til laboratorieenheten. Forskere vil utføre levende leverceller isolering og lagring under sterile forhold. Deretter vil leverceller bli analysert med FACSARIA III og brukt til videre in vitro eksperimenter.

Væskebiopsi vil bli utført på nytt 30. postoperativ dag ved første polikliniske besøk, og deretter hver sjette måned, i samsvar med og parallelt med lokale oppfølgingsprotokoller. Flytende biopsi utført under oppfølging vil bli behandlet som den preoperative, under de normale testene gitt for kliniske formål. Oppfølgingen stenges ved 30 måneder.

Alle operasjoner vil bli utført av kirurger med stor erfaring innen leverkirurgi. Reseksjonsteknikken vil være etter kirurgens preferanse, i henhold til lokal protokoll, god klinisk praksis og nasjonale retningslinjer. Alle kirurger vedtok de samme kriteriene for å velge den kirurgiske strategien: baselinevariabler for leverfunksjon, tumorplassering og diameter, og antall knuter. Restaging Ultrasonography (US) vil bli utført intraoperativt for hver pasient. Etter fjerning av svulsten vil en patolog som er involvert i denne studien, prøve svulsten for å få en nyfrossen del av svulsten, med det relaterte friske levervevet, for å lagre det for videre analyse. Denne prøven bør utføres i henhold til internasjonale retningslinjer og lokal etisk avtale, og den skal alltid garantere riktig materiale for å utføre den histologiske diagnosen. Hvis vevet som er fjernet fra pasienten som er registrert i denne studien ikke tillater å utføre prøven for studien uten å påvirke den optimale histologiske diagnosen, vil pasienten bli ekskludert fra studien og ingen prøvetaking vil bli utført.

For alle pasienter vil 20 ml fastende blodprøve bli samlet i et sterilt vakuumrør. Innsamlingen vil skje samtidig med rutinemessige preoperative blodprøver eller planlagte oppfølgingskontroller, siden ingen andre invasive prosedyrer skal gis til pasienter siden de ble registrert i studien. Blodprøven lagres ved 4°C og håndteres innen 6 timer. Deretter vil 5 mL bli sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter ved 4°C, plasmafasen vil samles opp og fordeles i 1,5 mL sterile rør og lagres ved -80°C frem til bruk eller forsendelse. Deretter vil vi isolere perifere blod mononukleære celler (PBMC) gjennom Ficoll gradient fra de resterende 15 ml. Etter isolering vil levende PBMC fryses i standard media 20 % føtalt bovinserum (FBS) 10 % Dymethil Sulfoxide (DMSO) og lagres i flytende nitrogen frem til bruk.

For alle pasienter vil levervevsprøve bli samlet og tumor (T) del vil bli separert fra peritumor (PT) del. Fra T og PT vil vev bli isolert følgelig Humane Hepatocytter (HC), Kupffer-celler (KC), Liver Sinusoidal Endothelial Cells (LSEC) og Human Stellate Cells (HSC) under sterile forhold. Kort fortalt vil levervev legges i en petriskål og kuttes med steril skalpell. Deretter vil kuttet lever bli inkubert i et 50 ml rør med kollagenase P (1mg/ml) ved 37°C i 45 minutter. Etter inkubering vil kollagenase P bli inaktivert ved å tilsette 20 % FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS) og cellesuspensjon vil bli sentrifugert 50 g 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten, som inneholder ikke-parenkymale leverceller (NPC), vil bli samlet i et nytt 50 ml rør og pelleten vaskes med fosfatbufferløsning (PBS). HC og NPC vil fryses i standard media 20 % FBS 10 % DMSO og lagres i flytende nitrogen frem til bruk.

Et fragment av T og PT vil bli lagret i RNAlater-løsning ved -80°C. For CTC-identifikasjon vil PBMC bli tint, resuspendert i standardmedier og sortert med FACSARIA III (BD biovitenskap) gjennom EpCAM+, CD47+, CD133+. Prosentandelen enkeltpositive celler (EpCAM+, CD47+ og CD133+) og trippelpositive celler (EpCAM/CD47/CD133+++) vil bli evaluert og det totale CTC-tallet vil bli beregnet. CTC vil bli testet for deres replikative og invasive kapasitet. Ved å bruke celleproliferasjons- og invasjonsanalyse vil vi evaluere CTC-doblingstid (tid som trengs for at cellene skal dobles i antall), veksthastighet (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= antall celler på tidspunkt t, N(0)= antall celler på tidspunkt 0, t= tid) og invasjonshastighet.

Etter CTC-karakterisering vil vi analysere HC og NPC, ved å bruke de positive markørene som er beskrevet tidligere, for å evaluere den nøyaktige CTC-leveravledningen.

Det biologiske materialet vil bli sendt med ekspert privat transport og lagret til laboratoriet i "Università degli Studi del Piemonte Orientale".

Gjentaksmønstrene vil bli evaluert som følger. Lokalt residiv vil bli definert som et residiv på samme leversegment ved Parenchyma Sparing Resection, eller på den kirurgiske hekken av de nærmeste segmentene ved Anatomic Resection. Dermed vil det bli evaluert antall tilbakevendende knuter (enkelt versus multiple), plasseringen av residiv (intrahepatisk versus ekstrahepatisk eller begge deler), størrelsen på den viktigste tilbakevendende knuten og leversegmentet. Alle disse evalueringene ved tilbakefall vil bli gjort ved CT-skanning eller MR-skanning under oppfølging, slik de lokale oppfølgingsprotokollene gir.

Alle pasientene vil bli fulgt ved hjelp av en lokal protokoll inkludert måling av serum α-FP, total bilirubin, GGT, ALP, albumin, INR, blodtelling, elektrolytttelling, ultralyd, kontrastcomputertomografi (CT) eller magnetisk resonanstomografi (MRI) og kontorbesøk. Pasienter blir vanligvis kontrollert hver 3. måned i løpet av det første postoperative året og hver 6. måned deretter. Når residiv oppstod, diskuteres tilfellene i en tverrfaglig setting, som involverer radiolog, hepatolog, kirurg, intervensjonsradiolog, radioterapeut og onkolog. Overall-Survival (OS) er definert som tidsintervall (i måneder) fra operasjon til pasientens død. Data vil bli sensurert ved mistet pasient ved oppfølgingsscreeningen. Sykdomsfri overlevelse (DFS) er definert som tidsintervall (i måneder) fra operasjon til tilbakefall eller død. Ved ingen gjentakelse vil data bli sensurert på datoen for siste tilgjengelige oppfølging. Tumor-spesifikk overlevelse (TSS) er definert som tidsintervallet i måneder mellom operasjon og tumorrelatert død.