Rola krążących komórek nowotworowych jako markerów zaawansowanej choroby i rokowania w HCC

Biopsja płynna może pozwolić na lepszą stratyfikację pacjentów w zależności od ich szacunkowego rokowania. Podobnie jak w przypadku innych nowotworów (np. raka piersi), charakterystyka molekularna pozwala nie tylko lepiej zrozumieć patologiczne szlaki prowadzące do powstawania nowotworów i progresji, ale także opracować konkretne metody leczenia dostosowane do specyfiki choroby pacjenta. Biopsja płynna jest bardzo łatwa i tania w wykonaniu, gdyż polega na pobraniu prostej próbki krwi żylnej, która zostanie zbadana przez sortownik komórek w celu zidentyfikowania określonej populacji komórek.

W raku wątrobowokomórkowym często pomaga przy podwyższonym wskaźniku nawrotów: u pacjentów, którzy byli leczeni z zamiarem wyleczenia, w 70% przypadków nawrót. W takich przypadkach u pacjentów często występowała podstawowa choroba zapalna wątroby, taka jak marskość wątroby, która jako czynnik onkogenetyczny może powodować nawrót choroby. Marskość wątroby jest ogólnie dobrze znanym czynnikiem ryzyka rozwoju raka wątrobowokomórkowego. Z tego powodu w praktyce klinicznej prawie trudno jest rozróżnić, czy zdiagnozowany przez nas nowy guzek należy uznać za rzeczywistą wznowę pierwszego leczonego guza, czy też za wystąpienie de novo związane z niezmienionym podstawowym impulsem nowotworzenia, co może być skutecznie wyleczony dopiero po przeszczepieniu wątroby. Kilka badań retrospektywnych wykazało już przewagę wystąpienia de novo w odniesieniu do przeżycia wolnego od choroby i przeżycia całkowitego w porównaniu z rzeczywistym wystąpieniem przerzutów. Jednak nikt nie osiągnął żadnych konkretnych markerów klinicznych ani morfologicznych pozwalających na rozróżnienie tych dwóch stanów. Charakterystykę charakteru nawrotowego guzka uzyskano jedynie poprzez genetyczną i molekularną ocenę heterogeniczności guza. Niemniej jednak taka charakterystyka jest obecnie możliwa jedynie w celach badawczych i na materiale histologicznym, którego można dokonać dopiero po ostatecznej decyzji o ponownej operacji w celu leczenia rozważanej wznowy. Nadal brakuje wskazówek dotyczących leczenia nawrotu HCC po operacji. Nasza hipoteza opiera się na teorii „nasion i oleju”, która zasadniczo opiera się na dowodach na obecność krążących komórek nowotworowych (CTC) w krwiobiegu. Komórki te mogą rozprzestrzeniać się z pierwotnych nowotworów, co jest oznaką zaawansowanego nowotworu, który ma już cechę inwazyjności. Naszym zdaniem nowotwory we wczesnym stadium nie uwalniają CTC do krwioobiegu lub nie w takim samym tempie i jakości, jak guz zaawansowany. Za guz zaawansowany uznawano taki, który może już wykazywać inwazję mikronaczyniową i/lub satelitozę, co może być histologicznym objawem zaawansowanego i już uogólnionego stadium. Pacjenci z CTC zidentyfikowanymi podczas biopsji płynnej mogą wiązać się z gorszym rokowaniem, co odpowiada zwiększonemu odsetkowi wczesnych i ogólnych nawrotów, nawet w przypadku przeszczepu. Ponadto teoria „nasion i oleju” powiązana z „teorią ponownego zadomowienia” może uzasadniać z bioonkologicznego punktu widzenia przypadki nawrotu w warunkach przeszczepu, gdy cały narząd oraz względne onkogenetyczne czynniki ryzyka , traktuje się przez podstawienie. Wreszcie, z patofizjologicznego punktu widzenia, chcemy wykazać, że nawracające guzki wewnątrzwątrobowe (IM) powstają w wyniku wysiewu krążących komórek nowotworowych, co pozwala na lepsze zrozumienie karcynogenezy w tych nowotworach.

• Cel główny: ocena związku między zmiennością wartości CTC – oznaczaną w próbkach krwi – a przeżyciem całkowitym i przeżyciem wolnym od choroby u pacjentów z HCC przed i po operacji (resekcji lub przeszczepie).
• Cel drugorzędny: ocena, czy pozytywna identyfikacja CTC w próbkach krwi jest powiązana z wewnątrzwątrobowym wzorcem nawrotów przerzutów zarówno u pacjentów po resekcji, jak i u pacjentów po przeszczepieniu.
• Cel trzeci: ocena i monitorowanie roli różnych zmiennych klinicznych, biochemicznych, radiologicznych i histopatologicznych w określaniu nawrotu po operacji i ich ostatecznego związku z obecnością i częstością występowania CTC. Rekrutacja pacjentów będzie oceniana przez oddziały chirurgiczne tego badania, zwykle podczas wizyty ambulatoryjnej przed operacją chirurgiczną. W tym momencie pacjenci będą kandydatami do tego badania, a jeśli wyrażą zgodę na udział, badacze uzyskają pisemną zgodę. Zarejestrowani pacjenci będą kodowani za pomocą numeru alfanumerycznego w celu zachowania tożsamości. Naukowcy zatrudnieni w laboratorium, w którym będą analizowane CTC, nie będą mogli odnaleźć właściciela próbki i nie będą mieli dostępu do danych klinicznych (analiza ślepa).

Przed zabiegiem u każdego pacjenta zostanie pobrana płynna biopsja z krwi obwodowej (w tym samym czasie co rutynowe badanie krwi). Próbki zostaną wykorzystane do analizy szybkości i rodzaju CTC metodą FACSARIA III (BD bioscience). Podczas operacji doświadczony patolog pobierze świeży wycinek guza i prawie zdrową wątrobę, który wykorzysta skrawki do zwykłej oceny histologicznej, zgodnie z najlepszą praktyką kliniczną i międzynarodowymi wytycznymi. Pozostałe sekcje będą przechowywane na lodzie podczas transportu do jednostki laboratoryjnej. Naukowcy przeprowadzą izolację żywych komórek wątroby i przechowywanie ich w sterylnych warunkach. Następnie komórki wątroby zostaną poddane analizie za pomocą FACSARIA III i wykorzystane do dalszych eksperymentów in vitro.

Ponowna biopsja płynna zostanie wykonana w 30. dobie pooperacyjnej podczas pierwszej wizyty ambulatoryjnej, a następnie co 6 miesięcy, zgodnie i równolegle z lokalnymi protokołami kontroli. Biopsja płynna wykonana w okresie kontrolnym będzie traktowana jak biopsja przedoperacyjna, podczas normalnych badań przewidzianych do celów klinicznych. Dalsze działania zostaną zakończone po 30 miesiącach.

Wszystkie operacje będą wykonywane przez chirurgów z dużym doświadczeniem w chirurgii wątroby. Technikę resekcji zadecyduje chirurg, zgodnie z lokalnym protokołem, dobrą praktyką kliniczną i wytycznymi krajowymi. Wszyscy chirurdzy przyjęli te same kryteria przy wyborze strategii chirurgicznej: wyjściowe zmienne dotyczące czynności wątroby, lokalizacji i średnicy guza oraz liczby guzków. U każdego pacjenta śródoperacyjnie zostanie wykonana ultrasonografia ponownej oceny stopnia zaawansowania (USG). Po usunięciu guza patolog biorący udział w tym badaniu pobierze próbkę guza w celu uzyskania świeżo zamrożonego fragmentu guza wraz z powiązaną zdrową tkanką wątroby i przechowania go do dalszej analizy. Próbkę tę należy pobrać zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi i lokalnymi porozumieniami etycznymi i musi ona zawsze gwarantować właściwy materiał do przeprowadzenia diagnozy histologicznej. Jeżeli tkanka pobrana od pacjenta włączonego do tego badania nie pozwoli na pobranie próbki do badania bez wpływu na optymalną diagnozę histologiczną, pacjent zostanie wykluczony z badania i nie zostanie pobrane żadne pobranie próbki.

Od wszystkich pacjentów do sterylnej probówki próżniowej zostanie pobrana próbka krwi na czczo o objętości 20 ml. Pobranie zostanie przeprowadzone w tym samym czasie, co rutynowe przedoperacyjne próbki krwi lub planowane kontrole kontrolne, ponieważ od momentu włączenia pacjentów do badania nie należy podawać pacjentom żadnych innych procedur inwazyjnych. Próbka krwi będzie przechowywana w temperaturze 4°C i pobrana w ciągu 6 godzin. Następnie 5 ml będzie wirowane przy 3000 obr/min przez 10 minut w temperaturze 4°C, faza osocza zostanie zebrana i podzielona na porcje w jałowych probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywana w temperaturze -80°C do czasu użycia lub wysyłki. Następnie wyizolujemy komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) za pomocą gradientu Ficoll z pozostałych 15 ml. Po izolacji żywe PBMC zostaną zamrożone w standardowej pożywce 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10% sulfotlenku dymetylu (DMSO) i przechowywane w ciekłym azocie do czasu użycia.

Od wszystkich pacjentów zostanie pobrana próbka tkanki wątroby, a część nowotworowa (T) zostanie oddzielona od części okołoguzowej (PT). Z tkanki T i PT będą izolowane kolejno ludzkie hepatocyty (HC), komórki Kupffera (KC), sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby (LSEC) i ludzkie komórki gwiaździste (HSC) w sterylnych warunkach. W skrócie, tkankę wątroby umieszcza się na szalce Petriego i kroi sterylnym skalpelem. Następnie pociętą wątrobę inkubuje się w probówce o pojemności 50 ml z kolagenazą P (1 mg/ml) w temperaturze 37°C przez 45 minut. Po inkubacji, kolagenaza P zostanie inaktywowana poprzez dodanie 20% roztworu soli FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS), a zawiesinę komórek odwiruje się 50 g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Supernatant zawierający niemiąższowe komórki wątroby (NPC) zostanie zebrany do nowej probówki o pojemności 50 ml, a osad zostanie przemyty roztworem buforu fosforanowego (PBS). HC i NPC zostaną zamrożone w standardowej pożywce 20% FBS 10% DMSO i przechowywane w ciekłym azocie do czasu użycia.

Fragment T i PT będzie przechowywany w roztworze RNA w temperaturze -80°C. W celu identyfikacji CTC PBMC zostaną rozmrożone, ponownie zawieszone w standardowych pożywkach i posortowane za pomocą FACSARIA III (BD bioscience) poprzez EpCAM+, CD47+, CD133+. Oceniany będzie procent komórek pojedynczych pozytywnych (EpCAM+, CD47+ i CD133+) i komórek potrójnie pozytywnych (EpCAM/CD47/CD133+++) i obliczana będzie całkowita liczba CTC. CTC zostaną przetestowane pod kątem ich zdolności replikacyjnej i inwazyjnej. Stosując test proliferacji i inwazji komórek, ocenimy czas podwojenia CTC (czas potrzebny do podwojenia liczby komórek), szybkość wzrostu (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= liczba komórek w chwili t, N(0) = liczba komórek w chwili 0, t = czas) i współczynnik inwazji.

Po scharakteryzowaniu CTC przeanalizujemy HC i NPC, używając opisanych wcześniej markerów pozytywnych, w celu oceny dokładnego pochodzenia wątrobowego CTC.

Materiał biologiczny zostanie przesłany specjalistycznym transportem prywatnym i przechowywany w laboratorium na „Università degli Studi del Piemonte Orientale”.

Wzorce nawrotów zostaną ocenione w następujący sposób. Wznowę miejscową definiuje się jako nawrót w tym samym segmencie wątroby w przypadku resekcji oszczędzającej miąższ lub na zabezpieczeniu chirurgicznym najbliższych segmentów w przypadku resekcji anatomicznej. W ten sposób zostanie oceniona liczba guzków nawrotowych (pojedynczych lub mnogich), lokalizacja wznowy (wewnątrzwątrobowa lub pozawątrobowa lub oba), wielkość głównego guzka nawrotowego i segment wątroby. Cała ocena nawrotu zostanie dokonana za pomocą tomografii komputerowej lub rezonansu magnetycznego podczas obserwacji, zgodnie z lokalnymi protokołami kontroli.

Wszyscy pacjenci będą obserwowani zgodnie z lokalnym protokołem obejmującym pomiary α-FP w surowicy, bilirubiny całkowitej, GGT, ALP, albuminy, INR, morfologię krwi, liczbę elektrolitów, badanie USG, tomografię komputerową z kontrastem (CT) lub rezonans magnetyczny (MRI). i wizyty w gabinecie. Pacjenci są zwykle sprawdzani co 3 miesiące w pierwszym roku pooperacyjnym, a następnie co 6 miesięcy. W przypadku nawrotu choroby przypadki są omawiane na forum wielodyscyplinarnym, w skład którego wchodzą radiolog, hepatolog, chirurg, radiolog interwencyjny, radioterapeuta i onkolog. Całkowite przeżycie (OS) definiuje się jako odstęp czasu (w miesiącach) od operacji do śmierci pacjenta. W przypadku poluzowania pacjenta dane zostaną ocenzurowane podczas kontroli kontrolnej. Przeżycie wolne od choroby (DFS) definiuje się jako odstęp czasu (w miesiącach) od operacji do nawrotu choroby lub śmierci. W przypadku braku nawrotu dane zostaną ocenzurowane w dniu ostatniej dostępnej wizyty kontrolnej. Przeżycie specyficzne dla guza (TSS) definiuje się jako odstęp czasu w miesiącach pomiędzy operacją a śmiercią związaną z nowotworem.