Cirkulerande tumörcellers roll som markörer för avancerad sjukdom och prognos i HCC

Vätskebiopsi kan möjliggöra en bättre stratifiering av patienter enligt deras beräknade prognos. Liksom i andra tumörer (t.ex. bröstcancer), tillåter molekylär karakterisering inte bara att bättre förstå de patologiska vägar som leder till tumörbildning och progression, utan också att driva specifika behandlingar som är skräddarsydda efter patientsjukdomens specificitet. Flytande biopsi är mycket lätt och billigt att utföra, eftersom det består av ett enkelt venöst blodprov som kommer att undersökas av cellsorterare för att identifiera specifika cellpopulationer.

I hepatocellulärt karcinom är vanligt att hjälpa till med en förhöjd återfallsfrekvens: patienter som har behandlats med en kurativ avsikt, i 70% av fallen återfall. I dessa fall hade patienterna ofta en underliggande inflammatorisk leversjukdom, såsom cirros, som kan driva på återfallet som en onkogenetisk faktor. Cirros är en välkänd riskfaktor för att utveckla hepatocellulärt karcinom i allmänhet. På grund av detta är det i klinisk praxis nästan svårt att särskilja om den nya knölen vi har diagnostiserat ska betraktas som ett verkligt återfall av den först behandlade tumören, eller en de-novo-förekomst kopplad till den oförändrade underliggande tumörbildningsförstärkningen, vilket kan vara effektivt botas först efter levertransplantation. Flera retrospektiva studier har redan visat fördelen, i termer av sjukdomsfri överlevnad och total överlevnad, med en de-novo-förekomst i förhållande till en verklig metastaserande presentation. Ingen har dock nått några specifika kliniska eller morfologiska markörer för att skilja mellan dessa två tillstånd. Karakterisering av arten av den återkommande knölen har endast erhållits genom genetisk och molekylär utvärdering av tumörernas heterogenitet. Ändå är denna karakterisering numera endast möjlig med forskningsavsikt och på histologiska prover, som skulle kunna tillhandahållas först efter ett eventuellt beslut om omoperation för att behandla det övervägda återfallet. Indikation om hur man ska behandla HCC-recidiv efter operation saknas fortfarande. Vår hypotes är baserad på teorin om "frö och olja", som i grunden bygger på bevis på förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTC) i blodomloppet. Dessa celler kan spridas från de ursprungliga tumörerna som ett kännetecken för avancerad cancer, som redan har utvecklat invasiviteten. Det är vår uppfattning att tumörer i ett tidigt skede inte frisätter, eller inte i samma takt eller kvalitet, CTC i blodomloppet som avancerad tumör gör. Vi betraktade en avancerad tumör, den som redan kan ha mikrovaskulär invasion och/eller satellitos, vilket kan vara de histologiska tecknen på ett avancerat och redan systemiskt stadium. Patienter med CTC som identifierats vid flytande biopsi kan vara associerade med en försämrad prognos, vilket förklarar en ökad frekvens av tidiga återfall och totalt återfall, även vid transplantation. Dessutom kan teorin om "frö och olja", förknippad med "rehoming-teorin", från en bio-onkologisk synvinkel motivera fallen av återfall i transplantationsmiljön, när hela organet, och de relativa onkogenetiska riskfaktorerna , behandlas genom substitution. Slutligen, ur en patofysiologisk synvinkel, vill vi visa att återkommande intrahepatiska knölar (IM) beror på cirkulerande tumörcellers sådd, vilket möjliggör en bättre förståelse av karcinogenes i dessa tumörer.

• Primärt mål: att utvärdera sambandet mellan variation i CTC - bestämt i blodprover - och total överlevnad och sjukdomsfri överlevnad hos HCC-patienter före och efter operation (antingen resektion och transplantation).
• Sekundärt mål: att utvärdera om den positiva identifieringen av CTC i blodprover är associerad med det intrahepatiska metastasmönstret av återfall hos antingen resekerade patienter och transplanterade en.
• Tertiärt mål: att utvärdera och övervaka rollen av olika kliniska, biokemiska, radiologiska och histopatologiska variabler för att bestämma återfall efter operation och deras eventuella samband med förekomsten och frekvensen av CTC. Patientregistreringen kommer att bedömas av de kirurgiska avdelningarna i denna studie vanligen under poliklinikbesöket före den kirurgiska operationen. I det ögonblicket kommer patienter att vara kandidater för denna studie, och om de accepterar att delta kommer forskarna att få det skriftliga medgivandet. Inskrivna patienter kommer att kodas med ett alfanumeriskt nummer för att bevara identiteten. Forskare som kommer att vara anställda i laboratoriet där CTC kommer att analyseras kommer inte att kunna spåra ägaren till provet, och de kommer inte att ha tillgång till kliniska data (blind analys).

Före operationen för varje patient kommer flytande biopsi från perifert blod att samlas in (i samma tid som rutinmässig blodanalys). Prover kommer att användas för att analysera CTCs hastighet och typ av FACSARIA III (BD biovetenskap). Under operationen kommer en ny bit av tumören och levern att samlas in av en expertpatolog, som kommer att använda sektion(er) för den vanliga histologiska utvärderingen enligt bästa kliniska praxis och internationella riktlinjer. De återstående sektionerna kommer att hållas på is under transporten till laboratorieenheten. Forskare kommer att utföra levande leverceller isolering och lagring under sterila förhållanden. Därefter kommer leverceller att analyseras med FACSARIA III och användas för ytterligare in vitro-experiment.

Vätskebiopsi kommer att utföras igen den 30:e postoperativa dagen under det första polikliniska besöket, och därefter var sjätte månad, i enlighet med och parallellt med de lokala uppföljningsprotokollen. Vätskebiopsi som utförs under uppföljningen kommer att hanteras som den preoperativa, under de normala tester som tillhandahålls för kliniska ändamål. Uppföljningen kommer att avslutas vid 30 månader.

Alla operationer kommer att utföras av kirurger med stor erfarenhet av leverkirurgi. Resektionstekniken kommer att vara enligt kirurgens preferens, enligt lokalt protokoll, god klinisk praxis och nationella riktlinjer. Alla kirurger antog samma kriterier för att välja den kirurgiska strategin: baslinjevariabler för leverfunktion, tumörplacering och diameter och antal knölar. Restaging Ultrasonography (US) kommer att utföras intraoperativt för varje patient. Efter tumöravlägsnande kommer en patolog som är involverad i denna studie att ta prov på tumören för att erhålla en nyfryst del av tumören, med den relaterade friska levervävnaden, för att lagra den för vidare analys. Detta prov ska utföras i enlighet med internationella riktlinjer och lokala etiska överenskommelser, och det måste alltid garantera rätt material för att utföra den histologiska diagnosen. Om vävnaden som tagits bort från patienten som ingår i denna studie inte tillåter att provet för studien kan utföras utan att den optimala histologiska diagnosen påverkas, kommer patienten att uteslutas från studien och ingen provtagning kommer att utföras.

För alla patienter kommer 20 ml fastande blodprov att samlas in i ett sterilt vakuumrör. Insamlingen kommer att göras samtidigt med rutinmässiga preoperativa blodprover eller planerade uppföljningskontroller, eftersom inga andra invasiva förfaranden bör ges till patienterna sedan de deltog i studien. Blodprovet kommer att förvaras vid 4°C och hanteras inom 6 timmar. Sedan kommer 5 ml att centrifugeras vid 3000 rpm i 10 minuter vid 4°C, plasmafasen kommer att samlas upp och alikvoteras i 1,5 ml sterila rör och förvaras vid -80°C fram till användning eller leverans. Sedan kommer vi att isolera perifera mononukleära blodceller (PBMC) genom Ficoll-gradient från de återstående 15 ml. Efter isolering kommer levande PBMC att frysas i standardmedier 20 % fetalt bovinserum (FBS) 10 % dymetylsulfoxid (DMSO) och förvaras i flytande kväve fram till användning.

För alla patienter kommer levervävnadsprov att samlas in och tumördelen (T) kommer att separeras från peritumordelen (PT). Från T- och PT-vävnad kommer konsekvent att isoleras mänskliga hepatocyter (HC), Kupffer-celler (KC), sinusoidala endotelceller från levern (LSEC) och mänskliga stellatceller (HSC) under sterila förhållanden. Kortfattat kommer levervävnad att placeras i en petriskål och skäras med steril skalpell. Sedan kommer skuren lever att inkuberas i ett 50 ml rör med kollagenas P (1 mg/ml) vid 37°C i 45 minuter. Efter inkubation kommer kollagenas P att inaktiveras med tillsats av 20% FBS Hank's Balance Salt Solution (HBSS) och cellsuspension kommer att centrifugeras 50 g 5 minuter vid 4°C. Supernatanten, som innehåller icke-parenkymala leverceller (NPC), kommer att samlas upp i ett nytt 50 ml rör och pelleten kommer att tvättas med fosfatbuffertlösning (PBS). HC och NPC kommer att frysas i standardmedia 20% FBS 10% DMSO och lagras i flytande kväve fram till användning.

Ett fragment av T och PT kommer att lagras i RNAlater-lösning vid -80°C. För CTC-identifiering kommer PBMC att tinas, återsuspenderas i standardmedia och sorteras med FACSARIA III (BD biovetenskap) genom EpCAM+, CD47+, CD133+. Procentandelen enstaka positiva celler (EpCAM+, CD47+ och CD133+) och trippelpositiva celler (EpCAM/CD47/CD133+++) kommer att utvärderas och det totala CTC-talet kommer att beräknas. CTC kommer att testas för sin replikativa och invasiva förmåga. Med hjälp av cellproliferation och invasionsanalys kommer vi att utvärdera CTC-fördubblingstid (tid som behövs för att cellerna ska fördubblas i antal), tillväxthastighet (gr=[ln(N(t)/N(0)]/t; N(t)= antalet celler vid tidpunkten t, N(0)= antalet celler vid tidpunkten 0, t=tid) och invasionshastighet.

Efter CTC-karakterisering kommer vi att analysera HC och NPC, med hjälp av de positiva markörerna som beskrivits tidigare, för att utvärdera den exakta CTC-leverhärvan.

Det biologiska materialet kommer att skickas med sakkunnig privat transport och lagras till laboratoriet i "Università degli Studi del Piemonte Orientale".

Återfallsmönstren kommer att utvärderas enligt följande. Lokalt återfall kommer att definieras som ett återfall på samma leversegment vid parenkymsparande resektion, eller på den kirurgiska häcken av de närmaste segmenten vid anatomisk resektion. Således kommer det att utvärderas antalet återkommande knölar (enkla mot multipla), platsen för återfall (intrahepatisk kontra extrahepatisk eller båda), storleken på den huvudsakliga återkommande knölen och leversegmentet. Alla dessa utvärderingar om återfall kommer att göras med datortomografi eller MR-undersökning under uppföljningen, som de lokala uppföljningsprotokollen tillhandahåller.

Alla patienter kommer att följas med hjälp av ett lokalt protokoll inklusive mätning av serum α-FP, totalt bilirubin, GGT, ALP, albumin, INR, blodvärde, elektrolytantal, ultraljud, kontrastdatortomografi (CT) eller magnetisk resonanstomografi (MRT) och kontorsbesök. Patienterna kontrolleras vanligtvis var tredje månad under det första postoperativa året och var sjätte månad därefter. När återfallet inträffade diskuteras fallen i en multidisciplinär miljö, där radiolog, hepatolog, kirurg, interventionsradiolog, radioterapeut och onkolog är involverad. Total-Survival (OS) definieras som tidsintervall (i månader) från operation till patientens död. Data kommer att censureras i händelse av förlorad patient vid uppföljningsscreeningen. Sjukdomsfri överlevnad (DFS) definieras som tidsintervall (i månader) från operation till återfall eller död. I händelse av ingen upprepning kommer data att censureras vid datumet för den senaste tillgängliga uppföljningen. Tumörspecifik överlevnad (TSS) definieras som tidsintervallet i månader mellan operation och tumörrelaterad död.