原発性副甲状腺機能亢進症と腸内細菌叢 (HYPOGEUM)

メソッド。 プロジェクトは 3 つの作業パッケージ (WP) で構成されます。 WP1. PHPT 患者が骨量減少を発症する傾向が、便のマイクロバイオームの組成によって予測できるかどうかを判断します (月 0 ～ 11)。 PHPT と診断された 30 歳から 80 歳の男女をスクリーニングし、3 部位の DXA (腰椎、股関節、橈骨遠位端 - 1/3 と超遠位の両方)、および骨代謝マーカーによって評価します。 それぞれ45人の患者を含む2つのグループが登録されます：1）正常なBMDまたは軽度の骨減少症（遠位半径Tスコア> -1.5）、脆弱性骨折のない被験者、および正常な骨代謝回転に関連するCTXレベル（100〜250 pg / ml） ) (骨の緩みではありません)。 ２）骨粗鬆症（遠位橈骨Ｔスコア＜－２．５）を有し、１つまたは複数の脆弱性骨折を伴うまたは伴わない）および活動性疾患に関連するＣＴＸレベル（＞５００ｐｇ／ｍｌ）（骨の緩み）を有する対象。 血液サンプルと糞便サンプルは、各参加者によって収集されます。 糞便サンプルは、-20°C のフリーザー パックを備えたクーラーにすぐに保存され、メタゲノム ショットガン シーケンスおよびマイクロバイオーム コミュニティ構造の分析のために COSMOSID に出荷されるまで、-80°C で保存されます。

Metagenomics Shotgun シーケンシングと分析。 各糞便サンプルのマイクロバイオームの多様性と組成は、メリーランド州ロックビルの CosmosID Inc. によって決定されます。 簡単に言うと、QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit を使用して、ヒト糞便サンプルから DNA を分離します。 DNAライブラリーは、イルミナNextera XTライブラリー調製キットを使用して調製され、ライブラリーの量はQubit（ThermoFisher）で評価されます。 その後、ライブラリーはイルミナ HiSeq プラットフォーム 2x150bp でシーケンスされます。 シーケンスリードのバイオインフォマティクス分析は、高性能データマイニングアルゴリズムと高度に精選された動的比較データベースGenBook®を使用するCosmosIDバイオインフォマティクスプラットフォームによって行われます。

エンドポイントと解釈: 骨が緩んでいる PHPT 患者が、コントロール PHPT 患者と比較して、1 つ以上の Th17 細胞誘導 SFB 相当細菌の頻度が高いかどうかを判断します。 したがって、この分析により、PHPT の骨量減少を悪化させる可能性のある種や菌株に関する証拠が得られます。 DXA エンドポイントは、遠位および橈骨の 1/3、腰椎および股関節の BMD、T スコアおよび Z スコアになります。

検出力の計算: 予備データセットの分析により、BL は平均相対存在量が ~5.8% (SD 0.055) で豊富であることが明らかになりました。 これらのデータから、グループごとに 45 人を登録すると、BL の平均相対存在量がコントロールと比較して骨密度の低い PHPT 患者で > 1.5 倍 (8.7%) 高い場合、BL の差を検出する 80% の統計的検出力が得られると計算されました。 PHPT患者。

WP2. GM 組成がヒトの免疫系をどのように調節するかを評価します (3 ～ 10 か月)。 Thサブセットを評価するために、FOXP3、IL-17A、TNF-αおよびIL-4遺伝子発現を測定するリアルタイムRT-PCRによってT細胞を分析する。 簡単に言えば、赤血球を末梢血サンプルで溶解し、全有核細胞を収集し、RNA 抽出まで-80°C で凍結します。 RNA は、標準的な手順に従って、TRIzol 試薬、クロロホルム抽出、およびその後のイソプロパノール沈殿を使用して分離されます。 相対サイトカイン発現は、β-アクチンに対する正規化を伴う2-ΔΔCT法を使用して決定されます。 炎症を評価するために、IL-17A (Th17 細胞によって産生される IL-17 の主な種)、遊離 RANKL、OPG、TNF を ELISA 法で測定します。 骨代謝回転を評価するために、P1NP（骨形成のマーカー）、CTX（骨吸収のマーカー）、25OHビタミンD（25OHD）をELISA法で測定します。

エンドポイントと解釈。 データは、骨吸収率、Th 細胞サブセット、IL-17 および他のサイトカインの血清レベルの間の相関関係の存在を明らかにします。 GMの構成が病気の活動を反映していることがわかるはずです。このデータは、PHPT の骨格合併症を緩和するプロバイオティクスなど、抗生物質やその他の介入の有効性を判断するための将来の介入研究の基盤として役立ちます。 また、骨格疾患のあるPHPT患者は、骨格疾患のない患者よりも25OHDレベルが低いと予想されます. 25OHD レベルと、Th17 細胞形成に有利な細菌種および菌株との間の相関関係を見つける必要があります。このデータは、25OHD レベルが PHPT の骨疾患の傾向にどのように影響するかについての新しいメカニズム情報を提供します。 これが事実である場合、将来の介入研究の非常に魅力的な主題は、ビタミン D の補充が骨格疾患に関連しない微生物叢の組成を回復させるという命題になるでしょう.

リスク分析と危機管理計画。 エストロゲン欠乏は Th17 細胞を増殖させ、それらによる IL-17 の産生は、ヒトの閉経後の骨量減少に寄与する可能性があります。 この効果は重要な交絡因子を表している可能性があり、閉経後の初期の女性で PHPT によって誘発される骨量減少における IL-17 の役割の評価を制限する可能性があります。 必要に応じて、性別、年齢、更年期の影響を統計的に調整することで、この制限を管理します。

WP3. GM 組成と T 細胞の活性化との因果関係を評価します (6 ～ 10 か月)。 Th 細胞が SFB 相当細菌からのタンパク質によって直接刺激されるかどうかを評価するために、BL ATCC 15707 に対して直接末梢血単核細胞 (PBMC) をテストし、ELISPOT 技術によって応答 T 細胞のタイプを評価します。 簡単に説明すると、末梢血で Th17 細胞が増加した 10 人の患者からの PBMC を BL ATCC 15707 に対してテストし、IL-17、TNF α、および RANKL の産生を ELISPOT 分析によってテストします。 PBMC 内のこれらのサイトカインは、活性化後に T 細胞によって特異的に産生されます。 ELISPOT 技術により、1 回の実験で複数のタンパク質をテストできます。 IL-17 以外の TNF α および RANKL は、申請者としてサイトカインの候補として選択されており、閉経後骨粗鬆症に罹患した患者の T 細胞におけるこれらのサイトカインのレベルの増加が以前に示されています。 BL ATCC 15707 に対する T 細胞の直接的な活性化が見つかれば、Fluidigm C1 システムを用いた単一細胞 RNA シーケンシング技術 (scRNA-seq) の使用により、活性化に関与する T 細胞のタイプがさらに特徴付けられます。セルごとのより詳細なシーケンスが可能になります (約 200.000 の読み取り値)。 手短に言えば、5 人のレスポンダー患者からの PBMC 細胞を、ATCC 15707 または対照微生物 (B. fragilis) 6 時間。 インキュベーション後、T細胞は、負の免疫磁気細胞分離システムによって総血液有核細胞によって分離され、scRNA-seqで評価されます。 scRNA-seq を使用すると、活性化 T 細胞とその遺伝子発現のエンドポイントと解釈を特徴付けることができます。 ATC C 15707 が T 細胞を直接活性化できるかどうかを判断し、さらに応答する T 細胞のタイプを特徴付けます。 これにより、研究の最初の部分で得られた関連データを確認し、GM、免疫活性化、および骨量減少の間の関係について機械論的な洞察を提供することができます.

リスク分析と危機管理計画。 末梢血中の Th17 数が増加した患者の T 細胞が ATCC 15707 による免疫チャレンジに積極的に反応しない場合、PHPT 骨喪失者の GM で増加した他の微生物に対する T 細胞の反応性をテストします。 Th17 細胞を刺激できる GM 株は、WP1 で得られた結果に従って選択されます。 陽性の T 細胞活性化を定義するために、予備データと PI によって公開された以前の結果に従って、陽性結果の 70% のしきい値を免疫チャレンジに設定しました。