Primární hyperparatyreóza a střevní mikrobiota (HYPOGEUM)

Metody. Projekt bude organizován ve třech pracovních balíčcích (WP). WP1. Zjistěte, zda lze sklon pacientů s PHPT k rozvoji úbytku kostní hmoty předvídat podle složení mikrobiomu stolice (měsíc 0-11). Budeme provádět screening mužů a žen ve věku 30-80 let s diagnózou PHPT a hodnocenou pomocí DXA na 3 místech (bederní páteř, kyčle a distální radius – 1/3 i ultra-distální) a markery kostního obratu. Budou zařazeny dvě skupiny po 45 pacientech: 1) Subjekty s normální BMD nebo mírnou osteopenií (t-skóre distálního radia > -1,5), bez zlomenin z křehkosti a s hladinami CTX, které jsou spojeny s normálním kostním obratem (100-250 pg/ml ) (ne volnější kost). 2) Subjekty s osteoporózou (t-skóre distálního radia < -2,5) s nebo bez jedné nebo více zlomenin z křehkosti) a hladinami CTX, které jsou spojeny s aktivním onemocněním (>500 pg/ml) (volnější kost). Každý účastník odebere vzorky krve a vzorek stolice. Vzorky stolice budou okamžitě uloženy v chladničce s mrazicími baleními -20 °C a skladovány při -80 °C, dokud nebudou odeslány do COSMOSID pro sekvenování metagenomické brokovnice a analýzu struktury komunity mikrobiomu.

Metagenomics Shotgun sekvenování a analýza. Diverzitu mikrobiomu a složení každého vzorku stolice určí CosmosID Inc., Rockville, MD. Stručně řečeno, DNA ze vzorků lidské stolice bude izolována pomocí QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit. Knihovny DNA budou připraveny pomocí soupravy pro přípravu knihovny Illumina Nextera XT a množství knihovny hodnocené pomocí Qubit (ThermoFisher). Knihovny budou poté sekvenovány na platformě Illumina HiSeq 2x150bp. Bioinformatickou analýzu sekvenačních čtení bude provádět bioinformatická platforma CosmosID, která využívá vysoce výkonné algoritmy dolování dat a vysoce kurátorskou dynamickou komparační databázi GenBook®.

Cílové body a interpretace: Zjistíme, zda pacienti s PHPT, kteří ztratili kost, mají vyšší frekvenci jedné nebo více bakterií indukujících buňky Th17-SFB ekvivalentní ve srovnání s kontrolními pacienty s PHPT. Tato analýza tedy poskytne důkazy týkající se druhů a kmenů, které mohou zhoršit ztrátu kostní hmoty u PHPT. Koncové body DXA budou BMD, T-skóre a Z-skóre distálního a 1/3 radia, bederní páteře a kyčle.

Výpočet síly: Naše analýza předběžného souboru dat odhalila, že BL byl hojný při průměrné relativní hojnosti ~5,8 % (SD 0,055). Z těchto údajů jsme vypočítali, že zařazení 45 na skupinu poskytne 80% statistickou sílu detekce rozdílu pro BL, pokud je průměrná relativní abundance BL > 1,5krát (8,7 %) vyšší u pacientů s PHPT s nízkou hustotou kostí ve srovnání s kontrolou. pacientů s PHPT.

WP2. Vyhodnoťte, jak GM složení moduluje imunitní systém u lidí (měsíc 3-10). Aby bylo možné vyhodnotit podskupiny Th, budou T buňky analyzovány pomocí RT-PCR v reálném čase měření exprese genů FOXP3, IL-17A, TNF-alfa a IL-4. Stručně, červené krvinky budou lyžovány ve vzorcích periferní krve a celkové buňky s jádry se shromáždí a zmrazí při -80 °C až do extrakce RNA. RNA bude izolována pomocí činidla TRIzol, extrakce chloroformem a následné precipitace isopropanolem podle standardního postupu. Relativní exprese cytokinů bude stanovena pomocí metody 2-AACT s normalizací na β-Aktin. Za účelem hodnocení zánětu budeme měřit IL-17A (hlavní druh IL-17 produkovaný buňkami Th17), volný RANKL, OPG, TNF technikou ELISA. K posouzení kostního obratu P1NP (marker kostní tvorby), CTX (marker kostní resorpce), 25OHvitamin D (25OHD) budou měřeny technikou ELISA.

Koncové body a interpretace. Data odhalí existenci korelací mezi rychlostí kostní resorpce, podskupinou Th buněk a sérovými hladinami IL-17 a dalších cytokinů. Pokud zjistíme, že složení GM odráží aktivitu nemoci; data budou sloužit jako základ pro budoucí intervenční studie ke stanovení účinnosti antibiotik nebo jiných intervencí, jako jsou například probiotika, při zmírňování kosterních komplikací PHPT. Očekáváme také, že pacienti s PHPT s onemocněním skeletu budou mít nižší hladiny 25OHD než pacienti bez onemocnění skeletu. Měli bychom najít korelaci mezi hladinami 25OHD a bakteriálními druhy a kmeny, která podporuje tvorbu buněk Th17; data poskytnou nové mechanické informace o tom, jak hladiny 25OHD ovlivňují náchylnost k onemocnění kostí u PHPT. Pokud by tomu tak bylo, velmi atraktivním předmětem pro budoucí intervenční studii bude návrh, že náhrada vitaminu D obnoví složení mikrobioty, které není spojeno s onemocněním skeletu.

Analýza rizik a krizový plán. Deficit estrogenu rozšiřuje buňky Th17 a jejich produkce IL-17 může přispívat k postmenopauzálnímu úbytku kostní hmoty u lidí. Tento účinek by mohl představovat důležitý matoucí faktor, který může omezit hodnocení role IL-17 při ztrátě kostní hmoty indukované PHPT u časně postmenopauzálních žen. V případě potřeby toto omezení zvládneme statistickým očištěním o vliv pohlaví, věku a menopauzy.

WP3. Vyhodnoťte kauzální vztah mezi složením GM a aktivací T buněk (měsíc 6-10). Abychom vyhodnotili, zda jsou Th buňky přímo stimulovány proteiny z bakterií ekvivalentních SFB, budeme testovat mononukleární buňky periferní krve (PBMC) přímo na BL ATCC 15707 a vyhodnotit typ odpovídajících T buněk technikou ELISPOT. Stručně řečeno, PBMC od 10 pacientů se zvýšenými Th17 buňkami v periferní krvi budou testovány proti BL ATCC 15707 a produkce IL-17, TNF alfa a RANKL bude testována pomocí ELISPOT analýz. Tyto cytokiny v PBMC jsou produkovány specificky T buňkami po jejich aktivaci. Technika ELISPOT umožňuje testování více proteinů v jednom experimentu. TNF alfa a RANKL jiné než IL-17 byly vybrány jako kandidátní cytokiny jako žadatel a jiní již dříve prokázali zvýšenou hladinu těchto cytokinů v T buňkách od pacientů postižených postmenopauzální osteoporózou. Pokud najdeme přímou aktivaci T buněk na BL ATCC 15707, bude typ T buněk zodpovědný za aktivaci dále charakterizován díky použití techniky sekvenování jednobuněčné RNA (scRNA-seq) se systémem Fluidigm C1 as umožňuje hlubší sekvenování na buňku (asi 200 000 čtení). Stručně řečeno, buňky PBMC od 5 pacientů, kteří reagují, budou vystaveni ATCC 15707 nebo kontrolnímu mikrobu (B. fragilis) po dobu 6 hodin. Po inkubaci budou T-buňky odděleny od všech jaderných buněk v krvi pomocí negativního imunomagnetického buněčného izolačního systému a vyhodnoceny pomocí scRNA-seq. Použití scRNA-seq nám umožní charakterizovat aktivované T-buňky a jejich genovou expresi Koncové body a interpretaci. Zjistíme, zda je ATC C 15707 schopen přímo aktivovat T buňky a dále charakterizujeme typ odpovídajících T buněk. To nám umožní potvrdit asociační data získaná v první části studie a poskytnout mechanický pohled na vztah mezi GM, imunitní aktivací a ztrátou kostní hmoty.

Analýza rizik a krizový plán. Pokud T buňky od pacientů se zvýšeným počtem Th17 v periferní krvi nebudou pozitivně reagovat na imunitní výzvu ATCC 15707, budeme testovat reaktivitu T buněk vůči jiným mikrobům zvýšenou v GM kostních úbytků PHPT. GM kmen schopný stimulovat Th17 buňky bude vybrán podle výsledků získaných ve WP1. Abychom definovali pozitivní aktivaci T buněk, nastavili jsme práh 70 % pozitivních výsledků pro imunitní provokaci podle našich předběžných údajů a předchozích výsledků publikovaných PI.