Primaire hyperparathyreoïdie en darmmicrobiota (HYPOGEUM)

methoden. Het project zal worden georganiseerd in drie werkpakketten (WP). WP1. Bepaal of de neiging van patiënten met PHPT om botverlies te ontwikkelen kan worden voorspeld door de samenstelling van het microbioom van de ontlasting (maand 0-11). We screenen mannen en vrouwen in de leeftijd van 30-80 jaar met de diagnose PHPT en geëvalueerd door DXA op 3 locaties (lumbale wervelkolom, heup en distale radius - zowel 1/3 als ultra-distaal) en markers voor botomzetting. Twee groepen met elk 45 patiënten zullen worden ingeschreven: 1) Proefpersonen met normale BMD of milde osteopenie (distale radius T-score > -1,5), geen fragiliteitsfracturen en CTX-waarden die geassocieerd zijn met normale botombouw (100-250 pg/ml ) (niet bot losser). 2) Proefpersonen met osteoporose (distale radius T-score < -2,5) met of zonder één of meer fragiliteitsfracturen) en CTX-waarden die verband houden met actieve ziekte (>500 pg/ml) (botlosser). Bij elke deelnemer worden bloedmonsters en een fecesmonster afgenomen. Ontlastingsmonsters worden onmiddellijk opgeslagen in een koelbox met diepvriesverpakkingen van -20 °C en bewaard bij -80 °C totdat ze naar COSMOSID worden verzonden voor Metagenomic Shotgun-sequencing en analyse van de structuur van de microbioomgemeenschap.

Metagenomics Shotgun-sequencing en -analyse. De diversiteit en samenstelling van het microbioom van elk ontlastingsmonster zal worden bepaald door CosmosID Inc., Rockville, MD. In het kort, DNA uit menselijke fecesmonsters zal worden geïsoleerd met behulp van de QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit. DNA-bibliotheken worden voorbereid met behulp van de Illumina Nextera XT-bibliotheekvoorbereidingskit en de bibliotheekhoeveelheid wordt beoordeeld met Qubit (ThermoFisher). Bibliotheken worden vervolgens gesequenced op een Illumina HiSeq-platform 2x150bp. Bio-informatica-analyse van sequencing-uitlezingen zal worden uitgevoerd door het bio-informatica-platform CosmosID dat gebruikmaakt van krachtige datamining-algoritmen en de sterk samengestelde dynamische comparator-database GenBook®.

Eindpunten en interpretatie: We zullen bepalen of PHPT-patiënten die bot verliezen een hogere frequentie hebben van een of meer Th17-cel-inducerende-SFB-equivalente bacteriën in vergelijking met PHPT-controlepatiënten. Deze analyse zal daarom bewijs opleveren met betrekking tot soorten en stammen die botverlies in PHPT kunnen verergeren. De DXA-eindpunten zijn BMD, T-scores en Z-scores van de distale en 1/3 radius, lumbale wervelkolom en heup.

Vermogensberekening: onze analyse van de voorlopige gegevensset onthulde dat BL overvloedig aanwezig was met een gemiddelde relatieve overvloed van ~ 5,8% (SD 0,055). Uit deze gegevens hebben we berekend dat het inschrijven van 45 per groep 80% statistisch vermogen zal opleveren voor het detecteren van een verschil voor BL als de gemiddelde relatieve overvloed van BL> 1,5 keer (8,7%) hoger is bij PHPT-patiënten met een lage botdichtheid in vergelijking met controle PHPT-patiënten.

WP2. Evalueer hoe GM-samenstelling het immuunsysteem bij mensen moduleert (maand 3-10). Om Th-subsets te evalueren, zullen T-cellen worden geanalyseerd door real-time RT-PCR die FOXP3-, IL-17A-, TNF-alfa- en IL-4-genexpressie meten. In het kort, rode bloedcellen zullen worden gelyseerd in perifere bloedmonsters en het totale aantal cellen met kern zal worden verzameld en ingevroren bij -80°C tot RNA-extractie. RNA zal worden geïsoleerd met behulp van TRIzol-reagens, chloroformextractie en daaropvolgende isopropanolprecipitatie volgens de standaardprocedure. De relatieve cytokine-expressie zal worden bepaald met behulp van de 2-ΔΔCT-methode met normalisatie naar β-actine. Om ontsteking te evalueren, zullen we IL-17A (de belangrijkste soort IL-17 geproduceerd door Th17-cellen), vrij RANKL, OPG, TNF meten met ELISA-techniek. Om de botomzetting te beoordelen zullen P1NP (een marker van botvorming), CTX (een marker van botresorptie), 25OHvitamine D (25OHD) worden gemeten met de ELISA-techniek.

Eindpunten en interpretatie. De gegevens zullen het bestaan ​​van correlaties onthullen tussen de snelheid van botresorptie, Th-cel subset en serumniveaus van IL-17 en andere cytokines. Moeten we vaststellen dat de samenstelling van de GM een weerspiegeling is van de activiteit van de ziekte; de gegevens zullen dienen als basis voor toekomstige interventiestudies om de werkzaamheid van antibiotica of andere interventies te bepalen, zoals bijvoorbeeld met probiotica bij het verminderen van de skeletcomplicaties van PHPT. We verwachten ook dat PHPT-patiënten met skeletaandoeningen lagere 25OHD-waarden zullen hebben dan patiënten zonder skeletaandoeningen. Moeten we een correlatie vinden tussen 25OHD-niveaus en bacteriesoorten en -stammen die de vorming van Th17-cellen bevorderen; de gegevens zullen nieuwe mechanistische informatie opleveren over hoe 25OHD-niveaus de neiging tot botziekte in PHPT beïnvloeden. Mocht dit het geval zijn, dan zal een zeer aantrekkelijk onderwerp voor een toekomstige interventiestudie de stelling zijn dat vitamine D-vervanging een microbiota-samenstelling zal herstellen die niet geassocieerd is met skeletaandoeningen.

Risicoanalyses en calamiteitenplan. Oestrogeendeficiëntie zet Th17-cellen uit en hun productie van IL-17 kan bijdragen aan postmenopauzaal botverlies bij mensen. Dit effect zou een belangrijke confounder kunnen zijn, die de beoordeling van de rol van IL-17 in het botverlies veroorzaakt door PHPT bij vrouwen in de vroege postmenopauze kan beperken. Indien nodig zullen we deze beperking beheersen door statistisch te corrigeren voor de effecten van geslacht, leeftijd en menopauze.

WP3. Evalueer de oorzakelijke relatie tussen GM-samenstelling en activering van T-cellen (maand 6-10). Om te evalueren of Th-cellen direct worden gestimuleerd door eiwitten van SFB-equivalente bacteriën, zullen we de perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) rechtstreeks testen op BL ATCC 15707 en het type reagerende T-cellen evalueren met behulp van de ELISPOT-techniek. In het kort, PBMC's van 10 patiënten met verhoogde Th17-cellen in perifeer bloed zullen worden getest tegen BL ATCC 15707 en de productie van IL-17, TNF-alfa en RANKL zal worden getest door middel van ELISPOT-analyses. Deze cytokines, binnen de PBMC's, worden specifiek geproduceerd door T-cellen na hun activering. Met de ELISPOT-techniek kunnen meerdere eiwitten in één experiment worden getest. Andere TNF-alfa en RANKL dan IL-17 zijn geselecteerd als kandidaat-cytokines, aangezien de aanvrager en anderen eerder een verhoogd niveau van deze cytokines hebben aangetoond in T-cellen van patiënten met postmenopauzale osteoporose. Mochten we een directe activering van T-cellen tegen BL ATCC 15707 vinden, dan zal het type T-cel dat verantwoordelijk is voor activering verder worden gekarakteriseerd dankzij het gebruik van eencellige RNA-sequencingtechniek (scRNA-seq) met het Fluidigm C1-systeem als het maakt een meer diepgaande sequentiëring per cel mogelijk (ongeveer 200.000 metingen). In het kort zullen PBMC-cellen van 5 responders-patiënten worden uitgedaagd met ATCC 15707 of met een controlemicrobe (B. fragilis) gedurende 6 uur. Na incubatie zullen T-cellen worden gescheiden door cellen met een totale kern in het bloed door middel van een negatief immunomagnetisch celisolatiesysteem, en geëvalueerd met scRNA-seq. Het gebruik van scRNA-seq zal ons in staat stellen geactiveerde T-cellen en hun genexpressie-eindpunten en interpretatie te karakteriseren. We zullen bepalen of ATC C 15707 T-cellen direct kan activeren en verder zullen we het type reagerende T-cel karakteriseren. Dit zal ons in staat stellen om de associatiegegevens verkregen in het eerste deel van de studie te bevestigen en een mechanistisch inzicht te geven in de relatie tussen GM, immuunactivatie en botverlies.

Risicoanalyses en calamiteitenplan. Als T-cellen van patiënten met een verhoogd aantal Th17 in het perifere bloed niet positief reageren op immuunuitdaging met ATCC 15707, zullen we de reactiviteit van T-cellen ten opzichte van andere microben testen die verhoogd zijn in de GM van PHPT-botverliezers. De GM-stam die Th17-cellen kan stimuleren, zal worden gekozen op basis van de resultaten verkregen in WP1. Om een ​​positieve activering van T-cellen te definiëren, hebben we een drempel van 70% van de positieve resultaten voor immuunuitdaging vastgesteld in overeenstemming met onze voorlopige gegevens en met eerdere resultaten gepubliceerd door de PI.