Primaarinen hyperparatyreoosi ja suoliston mikrobiota (HYPOGEUM)

menetelmät. Hanke järjestetään kolmeen työpakettiin (WP). WP1. Selvitä, voidaanko PHPT-potilaiden taipumus kehittää luukatoa ulosteen mikrobiomin koostumuksen perusteella (kuukausi 0-11). Seulomme 30–80-vuotiaat miehet ja naiset, joilla on diagnosoitu PHPT ja jotka arvioidaan 3-paikan DXA:lla (lanneselän, lonkan ja distaalinen säde – sekä 1/3 että ultradistaalinen) ja luun vaihtuvuusmarkkerit. Mukaan otetaan kaksi ryhmää, joissa kussakin on 45 potilasta: 1) Potilaat, joilla on normaali luun mineraalitiheys tai lievä osteopenia (distaalinen säde T-pistemäärä > -1,5), ei haurausmurtumia ja CTX-tasot, jotka liittyvät normaaliin luun vaihtumiseen (100-250 pg/ml). ) (ei luun löysää). 2) Potilaat, joilla on osteoporoosi (distaalinen säteen T-pistemäärä < -2,5) yhden tai useamman haurausmurtuman kanssa tai ilman) ja CTX-tasot, jotka liittyvät aktiiviseen sairauteen (>500 pg/ml) (luun löysempi). Jokainen osallistuja ottaa verinäytteitä ja ulostenäytteen. Ulostenäytteet säilytetään välittömästi jäähdyttimessä -20 °C:n pakastepakkauksissa ja säilytetään -80 °C:ssa, kunnes ne lähetetään COSMOSIDille Metagenomic Shotgun -sekvensointia ja mikrobiomiyhteisön rakenteen analysointia varten.

Metagenomics Haulikkosekvensointi ja -analyysi. CosmosID Inc., Rockville, MD, määrittää kunkin ulostenäytteen mikrobiomien monimuotoisuuden ja koostumuksen. Lyhyesti sanottuna ihmisen ulostenäytteistä peräisin oleva DNA eristetään QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro -sarjan avulla. DNA-kirjastot valmistetaan käyttämällä Illumina Nextera XT -kirjaston valmistelusarjaa ja kirjaston määrää Qubitilla (ThermoFisher). Tämän jälkeen kirjastot sekvensoidaan Illumina HiSeq -alustalla 2x150 bp. Sekvensointilukemien bioinformaattisen analyysin tekee CosmosID-bioinformatiikka-alusta, joka käyttää tehokkaita tiedonlouhintaalgoritmeja ja erittäin kuratoitua dynaamista vertailutietokantaa GenBook®.

Päätepisteet ja tulkinta: Selvitämme, onko luun menettävillä PHPT-potilailla suurempi esiintyvyys yhtä tai useampaa Th17-soluja indusoivaa SFB:tä vastaavaa bakteeria verrattuna kontrolli-PHT-potilaisiin. Tämä analyysi antaa siksi todisteita lajeista ja kannoista, jotka voivat pahentaa luun menetystä PHPT:ssä. DXA-päätepisteet ovat BMD, T-pisteet ja Z-pisteet distaalisessa ja 1/3 säteen, lannerangan ja lonkan alueella.

Tehon laskenta: Alustavan datajoukon analyysimme paljasti, että BL:ää oli runsaasti keskimääräisellä suhteellisella runsaudella ~5,8 % (SD 0,055). Näistä tiedoista laskettiin, että 45 henkilön rekisteröinti ryhmää kohden tarjoaa 80 %:n tilastollisen tehon BL:n eron havaitsemiseen, jos BL:n keskimääräinen suhteellinen runsaus on > 1,5 kertaa (8,7 %) korkeampi PHPT-potilailla, joilla on alhainen luutiheys verrattuna kontrolliin. PHPT-potilaat.

WP2. Arvioi, kuinka GM-koostumus moduloi ihmisen immuunijärjestelmää (kuukausi 3-10). Th-alaryhmien arvioimiseksi T-solut analysoidaan reaaliaikaisella RT-PCR:llä, joka mittaa FOXP3-, IL-17A-, TNF-alfa- ja IL-4-geenin ilmentymistä. Lyhyesti sanottuna punasolut hajotetaan ääreisverinäytteissä ja tumalliset solut kerätään ja pakastetaan -80 °C:ssa RNA:n uuttamiseen asti. RNA eristetään käyttämällä TRIzol-reagenssia, kloroformiuuttoa ja sitä seuraavaa isopropanolisaostusta standardimenettelyn mukaisesti. Suhteellinen sytokiinien ilmentyminen määritetään käyttämällä 2-ΔΔCT-menetelmää normalisoimalla β-aktiiniksi. Tulehduksen arvioimiseksi mittaamme ELISA-tekniikalla IL-17A:ta (Th17-solujen tuottaman IL-17:n päälaji), vapaan RANKL:n, OPG:n, TNF:n. Luun vaihtuvuuden arvioimiseksi ELISA-tekniikalla mitataan P1NP (luun muodostumisen merkki), CTX (luun resorption merkkiaine) ja 25OH D-vitamiini (25OHD).

Päätepisteet ja tulkinta. Tiedot paljastavat korrelaatioiden olemassaolon luun resorption nopeuden, Th-solujen alajoukon ja IL-17:n ja muiden sytokiinien seerumitasojen välillä. Pitäisikö meidän havaita, että GM:n koostumus heijastaa taudin aktiivisuutta? Aineisto toimii perustana tuleville interventiotutkimuksille, joilla selvitetään antibioottien tai muiden interventioiden, kuten esimerkiksi probioottien, tehokkuutta PHPT:n luustokomplikaatioiden lievittämisessä. Odotamme myös, että PHPT-potilailla, joilla on luuston sairaus, on alhaisemmat 25OHD-tasot kuin niillä, joilla ei ole luuston sairautta. Pitäisikö meidän löytää korrelaatio 25OHD-tasojen ja bakteerilajien ja -kantojen välillä, mikä suosii Th17-solujen muodostumista? tiedot tarjoavat uutta mekanistista tietoa siitä, kuinka 25OHD-tasot vaikuttavat luusairauden taipumuksiin PHPT:ssä. Jos näin on, erittäin houkutteleva aihe tulevassa interventiotutkimuksessa on ehdotus, jonka mukaan D-vitamiinin korvaaminen palauttaa mikrobiston koostumuksen, joka ei liity luuston sairauteen.

Riskianalyysit ja valmiussuunnitelma. Estrogeenin puute laajentaa Th17-soluja, ja niiden IL-17:n tuotanto voi myötävaikuttaa postmenopausaaliseen luukadoon ihmisillä. Tämä vaikutus saattaa olla tärkeä hämmentävä tekijä, joka voi rajoittaa IL-17:n roolin arviointia PHPT:n aiheuttamassa luukadossa varhaisen postmenopausaalisilla naisilla. Tarvittaessa hallitsemme tätä rajoitusta tilastollisesti mukauttamalla sukupuolen, iän ja vaihdevuosien vaikutuksia.

WP3. Arvioi GM-koostumuksen ja T-solujen aktivoitumisen välinen syy-yhteys (kuukausi 6-10). Arvioidaksemme, stimuloivatko Th-solut suoraan SFB-vastaavien bakteerien proteiinit, testaamme perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC:t) suoraan BL ATCC 15707:ää vastaan ​​ja arvioimme reagoivien T-solujen tyypin ELISPOT-tekniikalla. Lyhyesti sanottuna, PBMC:t 10 potilaalta, joilla on lisääntynyt Th17-solut ääreisveressä, testataan BL ATCC 15707:ää vastaan ​​ja IL-17:n, TNF-alfan ja RANKL:n tuotanto testataan ELISPOT-analyyseillä. Näitä sytokiinejä PBMC:issä tuottavat spesifisesti T-solut niiden aktivoinnin jälkeen. ELISPOT-tekniikka mahdollistaa useiden proteiinien testaamisen yhdessä kokeessa. TNF-alfa ja muu RANKL kuin IL-17 on valittu ehdokassytokiineiksi, koska hakija ja muut ovat aiemmin osoittaneet näiden sytokiinien kohonneen tason postmenopausaalisesta osteoporoosista kärsivien potilaiden T-soluissa. Jos havaitsemme T-solujen suoran aktivoitumisen BL ATCC 15707:ään, aktivaatiosta vastuussa olevan T-solun tyyppi karakterisoidaan tarkemmin käyttämällä yksisoluista RNA-sekvensointitekniikkaa (scRNA-seq) Fluidigm C1 -järjestelmän kanssa. se mahdollistaa syvemmän sekvensoinnin solua kohden (noin 200 000 lukemaa). Lyhyesti sanottuna PBMC-solut viideltä vasteen saaneelta potilaalta altistetaan ATCC 15707:llä tai kontrollimikrobilla (B. fragilis) 6 tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen T-solut erotetaan kokonaisveren tumallisten solujen avulla negatiivisella immunomagneettisella solun eristysjärjestelmällä ja arvioidaan scRNA-seq. scRNA-seq:n käyttö mahdollistaa aktivoituneiden T-solujen ja niiden geeniekspression päätepisteiden ja tulkinnan karakterisoinnin. Selvitämme, pystyykö ATC C 15707 aktivoimaan suoraan T-soluja, ja lisäksi karakterisoimme reagoivan T-solun tyypin. Tämä antaa meille mahdollisuuden vahvistaa tutkimuksen ensimmäisessä osassa saadut assosiaatiotiedot ja antaa mekaanisen käsityksen GM:n, immuuniaktivaation ja luukadon välisestä suhteesta.

Riskianalyysit ja valmiussuunnitelma. Jos T-solut potilailta, joilla on lisääntynyt Th17:n määrä ääreisveressä, eivät vastaa positiivisesti immuunialtistukseen ATCC 15707:llä, testaamme T-solujen reaktiivisuutta muita mikrobeja kohtaan, jotka ovat lisääntyneet PHPT-luun menettäjien GM:ssä. GM-kanta, joka pystyy stimuloimaan Th17-soluja, valitaan WP1:ssä saatujen tulosten mukaan. Positiivisen T-soluaktivaation määrittämiseksi asetimme kynnysarvoksi 70 % positiivisista tuloksista immuunialtistusta alustavien tietojemme ja PI:n aiempien tulosten mukaisesti.