Primær hyperparathyroidisme og tarmmikrobiota (HYPOGEUM)

Metoder. Prosjektet vil bli organisert i tre arbeidspakker (WP). WP1. Bestem om tilbøyeligheten til pasienter med PHPT til å utvikle bentap kan forutsies av sammensetningen av avføringsmikrobiom (måned 0-11). Vi vil screene menn og kvinner i alderen 30-80 år diagnostisert med PHPT og evaluert av 3-steds DXA (lumbal ryggrad, hofte og distal radius - både 1/3 og ultra-distale), og beinomsetningsmarkører. To grupper med 45 pasienter hver vil bli registrert: 1) Personer med normal BMD eller mild osteopeni (distal radius T-score > -1,5), ingen fragilitetsfrakturer og CTX-nivåer som er assosiert med normal beinomsetning (100-250 pg/ml) ) (ikke bein løsere). 2) Personer med osteoporose (distal radius T-score < -2,5) med eller uten ett eller flere skjørhetsfrakturer) og CTX-nivåer som er assosiert med aktiv sykdom (>500 pg/ml) (bein løsere). Blodprøver og en avføringsprøve vil bli tatt av hver deltaker. Avføringsprøver vil umiddelbart lagres i en kjøler med -20°C frysepakker og lagres ved -80°C til de sendes til COSMOSID for Metagenomic Shotgun-sekvensering og analyse av mikrobiometsamfunnets struktur.

Metagenomics hagle sekvensering og analyse. Mikrobiomets mangfold og sammensetning av hver avføringsprøve vil bli bestemt av CosmosID Inc., Rockville, MD. Kort fortalt vil DNA fra avføringsprøver fra mennesker bli isolert ved hjelp av QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit. DNA-biblioteker vil bli klargjort ved å bruke Illumina Nextera XT-bibliotekets forberedelsessett og biblioteksmengde vurdert med Qubit (ThermoFisher). Biblioteker vil deretter bli sekvensert på en Illumina HiSeq-plattform 2x150bp. Bioinformatisk analyse av sekvenseringsavlesninger vil bli utført av CosmosID bioinformatikkplattform som bruker høyytelses algoritmer for datautvinning og den svært kuraterte dynamiske komparatordatabasen GenBook®.

Sluttpunkter og tolkning: Vi vil avgjøre om PHPT-pasienter som mister bein har en høyere frekvens av én eller flere Th17-celle-induserende-SFB-ekvivalente bakterier sammenlignet med kontroll-PHT-pasienter. Denne analysen vil derfor gi bevis knyttet til arter og stammer som kan forverre bentap i PHPT. DXA-endepunktene vil være BMD, T-score og Z-score for distale og 1/3 radius, korsrygg og hofte.

Kraftberegning: Vår analyse av det foreløpige datasettet viste at BL var rikelig ved gjennomsnittlig relativ overflod på ~5,8 % (SD 0,055). Fra disse dataene beregnet vi at registrering av 45 per gruppe vil gi 80 % statistisk evne til å oppdage en forskjell for BL hvis den gjennomsnittlige relative forekomsten av BL er > 1,5 ganger (8,7 %) høyere hos PHPT-pasienter med lav bentetthet sammenlignet med kontroll PHPT-pasienter.

WP2. Evaluer hvordan GM-sammensetning modulerer immunsystemet hos mennesker (måned 3-10). For å evaluere Th-undersett, vil T-celler bli analysert ved sanntids RT-PCR som måler FOXP3, IL-17A, TNF-alfa og IL-4 genuttrykk. Kort fortalt vil røde blodlegemer lyseres i perifere blodprøver og totale kjerneholdige celler samles og fryses ved -80 °C inntil RNA-ekstraksjon. RNA vil bli isolert ved bruk av TRIzol-reagens, kloroformekstraksjon og påfølgende isopropanolutfelling i henhold til standard prosedyre. Relativt cytokinuttrykk vil bli bestemt ved bruk av 2-ΔΔCT-metoden med normalisering til β-aktin. For å evaluere inflammasjon vil vi måle IL-17A (hovedarten av IL-17 produsert av Th17-celler), fri RANKL, OPG, TNF ved ELISA-teknikk. For å vurdere beinomsetning P1NP (en markør for bendannelse), CTX (en markør for benresorpsjon), 25OHvitamin D (25OHD) vil bli målt med ELISA-teknikk.

Sluttpunkter og tolkning. Dataene vil avsløre eksistensen av korrelasjoner mellom hastigheten på benresorpsjon, Th-celleundergruppen og serumnivåer av IL-17 og andre cytokiner. Skulle vi finne at sammensetningen av GM reflekterer sykdommens aktivitet; dataene vil tjene som grunnlag for fremtidige intervensjonsstudier for å bestemme effekten av antibiotika eller andre intervensjoner som for eksempel med probiotika for å lindre skjelettkomplikasjoner av PHPT. Vi forventer også at PHPT-pasienter med skjelettsykdom vil ha lavere 25OHD-nivåer enn de uten skjelettsykdom. Skal vi finne en sammenheng mellom 25OHD-nivåer og bakteriearter og stammer som favoriserer Th17-celledannelse; dataene vil gi ny mekanistisk informasjon om hvordan 25OHD-nivåer påvirker tilbøyeligheten til beinsykdom i PHPT. Skulle dette være tilfelle, vil et svært attraktivt emne for en fremtidig intervensjonsstudie være påstanden om at vitamin D-erstatning vil gjenopprette en mikrobiotasammensetning som ikke er assosiert med skjelettsykdom.

Risikoanalyser og beredskapsplan. Østrogenmangel utvider Th17-celler og deres produksjon av IL-17 kan bidra til postmenopausalt bentap hos mennesker. Denne effekten kan representere en viktig konfounder, som kan begrense vurderingen av rollen til IL-17 i bentapet indusert av PHPT hos tidlig postmenopausale kvinner. Om nødvendig vil vi håndtere denne begrensningen ved å statistisk justere for effektene av kjønn, alder og overgangsalder.

WP3. Evaluer årsakssammenhengen mellom GM-sammensetning og T-celleaktivering (måned 6-10). For å evaluere om Th-celler er direkte stimulert av proteiner fra SFB-ekvivalente bakterier, vil vi teste de perifere mononukleære blodcellene (PBMCs) direkte mot BL ATCC 15707 og evaluere typen responderende T-celler ved hjelp av ELISPOT-teknikk. Kort fortalt vil PBMC fra 10 pasienter med økte Th17-celler i perifert blod bli testet mot BL ATCC 15707 og produksjonen av IL-17, TNF alfa og RANKL vil bli testet ved ELISPOT-analyser for. Disse cytokinene, i PBMC-ene, produseres spesifikt av T-celler etter deres aktivering. ELISPOT-teknikken gjør det mulig å teste flere proteiner i et enkelt eksperiment. Andre TNF alfa og RANKL enn IL-17 er valgt som kandidatcytokiner da søker og andre tidligere har vist økt nivå av disse cytokinene i T-celler fra pasienter som er rammet av postmenopausal osteoporose. Skulle vi finne en direkte aktivering av T-celler til BL ATCC 15707, vil typen T-celle som er ansvarlig for aktivering bli ytterligere karakterisert takket være bruken av encellet RNA-sekvenseringsteknikk (scRNA-seq) med Fluidigm C1-systemet som den tillater en mer dyptgående sekvensering per celle (ca. 200.000 avlesninger). Kort fortalt vil PBMC-celler fra 5 responderende pasienter bli utfordret med ATCC 15707 eller med en kontrollmikrobe (B. fragilis) i 6 timer. Etter inkubasjon vil T-celler bli separert av totale blodkjerneholdige celler ved et negativt immunomagnetisk celleisolasjonssystem, og evaluert med scRNA-seq. Bruken av scRNA-seq vil gjøre oss i stand til å karakterisere aktiverte T-celler og deres genuttrykk Sluttpunkter og tolkning. Vi vil avgjøre om ATC C 15707 er i stand til å aktivere T-celler direkte, og videre vil vi karakterisere typen responderende T-celle. Dette vil tillate oss å bekrefte assosiasjonsdataene innhentet i den første delen av studien og gi en mekanistisk innsikt i forholdet mellom GM, immunaktivering og bentap.

Risikoanalyser og beredskapsplan. Hvis T-celler fra pasienter med økt antall Th17 i det perifere blodet ikke vil svare positivt på immunutfordring med ATCC 15707, vil vi teste T-cellers reaktivitet mot andre mikrober økt i GM av PHPT-bentapere. GM-stamme i stand til å stimulere Th17-celler vil bli valgt i henhold til resultatene oppnådd i WP1. For å definere en positiv T-celleaktivering satte vi en terskel på 70% av positive resultater for immunutfordring i henhold til våre foreløpige data og med tidligere resultater publisert av PI.