Первичный гиперпаратиреоз и кишечная микробиота (HYPOGEUM)

Методы. Проект будет организован в виде трех рабочих пакетов (WP). РП1. Определите, можно ли предсказать склонность пациентов с ПГПТ к развитию потери костной массы по составу микробиома стула (месяц 0-11). Мы проведем скрининг мужчин и женщин в возрасте 30-80 лет с диагнозом ПГПТ и оценим их с помощью DXA в 3 точках (поясничный отдел позвоночника, бедро и дистальный отдел лучевой кости - как 1/3, так и ультрадистальный отдел) и маркеров ремоделирования костной ткани. Будут включены две группы по 45 пациентов в каждой: 1) Субъекты с нормальной МПК или легкой остеопенией (Т-показатель дистального радиуса > -1,5), отсутствием хрупких переломов и уровнями CTX, связанными с нормальным костным метаболизмом (100-250 пг/мл). ) (не слабее кости). 2) Субъекты с остеопорозом (Т-показатель дистального радиуса <-2,5) с одним или несколькими переломами или без них) и уровнями CTX, которые связаны с активным заболеванием (> 500 пг/мл) (более рыхлая кость). Образцы крови и образец фекалий будут взяты каждым участником. Образцы стула будут немедленно храниться в холодильнике с пакетами для замораживания при температуре -20°C и храниться при температуре -80°C до отправки в COSMOSID для метагеномного секвенирования и анализа структуры сообщества микробиома.

Секвенирование и анализ Metagenomics Shotgun. Разнообразие микробиома и состав каждого образца стула будут определяться CosmosID Inc., Роквилл, Мэриленд. Вкратце, ДНК из образцов фекалий человека будет выделена с использованием набора QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro. Библиотеки ДНК будут подготовлены с использованием набора для подготовки библиотек Illumina Nextera XT, а количество библиотек будет оценено с помощью Qubit (ThermoFisher). Затем библиотеки будут секвенированы на платформе Illumina HiSeq 2x150bp. Биоинформатический анализ прочтений секвенирования будет выполняться биоинформационной платформой CosmosID, которая использует высокопроизводительные алгоритмы интеллектуального анализа данных и тщательно отобранную базу данных динамического компаратора GenBook®.

Конечные точки и интерпретация: мы определим, имеют ли пациенты с PHPT, теряющие кость, более высокую частоту одной или нескольких бактерий, эквивалентных SFB, индуцирующих клетки Th17, по сравнению с контрольными пациентами с PHPT. Таким образом, этот анализ даст доказательства, относящиеся к видам и штаммам, которые могут усугубить потерю костной массы при ПГПТ. Конечными точками DXA будут МПК, Т- и Z-показатели дистального отдела и 1/3 лучевой кости, поясничного отдела позвоночника и бедра.

Расчет мощности: Наш анализ предварительного набора данных показал, что BL был многочисленным при средней относительной численности ~ 5,8% (SD 0,055). На основании этих данных мы рассчитали, что включение 45 человек в группу обеспечит 80% статистическую мощность обнаружения различий для BL, если средняя относительная распространенность BL> в 1,5 раза (8,7%) выше у пациентов с PHPT с низкой плотностью кости по сравнению с контрольной группой. пациенты с ПХТ.

РП2. Оцените, как состав ГМ модулирует иммунную систему человека (3-10 месяцев). Чтобы оценить подмножества Th, Т-клетки будут проанализированы с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени с измерением экспрессии генов FOXP3, IL-17A, TNF-альфа и IL-4. Вкратце, эритроциты будут лизироваться в образцах периферической крови, а все ядросодержащие клетки будут собраны и заморожены при -80°C до выделения РНК. РНК будет выделена с использованием реагента TRIzol, экстракции хлороформом и последующего осаждения изопропанолом в соответствии со стандартной процедурой. Относительную экспрессию цитокинов определят с использованием метода 2-ΔΔCT с нормализацией к β-актину. Чтобы оценить воспаление, мы будем измерять IL-17A (основной вид IL-17, продуцируемый клетками Th17), свободный RANKL, OPG, TNF методом ELISA. Для оценки обмена костной ткани методом ELISA будут измеряться P1NP (маркер образования кости), CTX (маркер резорбции кости), 25OHвитамин D (25OHD).

Конечные точки и интерпретация. Данные покажут наличие корреляции между скоростью резорбции кости, субпопуляцией Th-клеток и уровнями IL-17 и других цитокинов в сыворотке. Должны ли мы обнаружить, что состав GM отражает активность болезни; данные послужат основой для будущих интервенционных исследований для определения эффективности антибиотиков или других вмешательств, таких как, например, пробиотики в смягчении скелетных осложнений ПГПТ. Мы также ожидаем, что пациенты с PHPT с заболеванием скелета будут иметь более низкие уровни 25OHD, чем пациенты без заболевания скелета. Должны ли мы найти корреляцию между уровнями 25OHD и видами и штаммами бактерий, которая способствует образованию клеток Th17; данные предоставят новую механистическую информацию о том, как уровни 25OHD влияют на склонность к заболеванию костей при PHPT. Если это так, то очень привлекательным предметом для будущего интервенционного исследования будет предположение о том, что замена витамина D восстановит состав микробиоты, который не связан с заболеваниями скелета.

Анализ рисков и план на случай непредвиденных обстоятельств. Дефицит эстрогена увеличивает количество клеток Th17, и их продукция IL-17 может способствовать постменопаузальной потере костной массы у людей. Этот эффект может представлять собой важную помеху, которая может ограничить оценку роли IL-17 в потере костной массы, вызванной PHPT, у женщин в ранней постменопаузе. При необходимости мы справимся с этим ограничением путем статистической поправки на влияние пола, возраста и менопаузы.

РП3. Оцените причинно-следственную связь между составом GM и активацией Т-клеток (месяц 6-10). Чтобы оценить, стимулируются ли Th-клетки непосредственно белками из бактерий, эквивалентных SFB, мы проверим мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) непосредственно на BL ATCC 15707 и оценим тип реагирующих Т-клеток с помощью метода ELISPOT. Вкратце, РВМС от 10 пациентов с повышенным содержанием клеток Th17 в периферической крови будут протестированы на BL ATCC 15707, а продукция IL-17, TNF-альфа и RANKL будет проверена с помощью анализов ELISPOT. Эти цитокины внутри РВМС специфически продуцируются Т-клетками после их активации. Метод ELISPOT позволяет тестировать несколько белков в одном эксперименте. TNF-альфа и RANKL, отличные от IL-17, были выбраны в качестве цитокинов-кандидатов, поскольку заявитель и другие ранее показали повышенный уровень этих цитокинов в Т-клетках у пациентов, страдающих постменопаузальным остеопорозом. Если мы обнаружим прямую активацию Т-клеток BL ATCC 15707, тип Т-клеток, ответственных за активацию, будет дополнительно охарактеризован благодаря использованию метода секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) с системой Fluidigm C1 как он позволяет проводить более глубокое секвенирование на ячейку (около 200 000 показаний). Вкратце, клетки РВМС от 5 пациентов с ответом будут заражены ATCC 15707 или контрольным микробом (B. fragilis) в течение 6 часов. После инкубации Т-клетки будут разделены на общее количество ядерных клеток крови с помощью отрицательной системы выделения иммуномагнитных клеток и оценены с помощью scRNA-seq. Использование scRNA-seq позволит нам охарактеризовать активированные Т-клетки и экспрессию их генов. Конечные точки и интерпретация. Мы определим, способен ли ATC C 15707 напрямую активировать Т-клетки, и далее мы охарактеризуем тип реагирующих Т-клеток. Это позволит нам подтвердить данные об ассоциации, полученные в первой части исследования, и обеспечить механистическое понимание взаимосвязи между GM, иммунной активацией и потерей костной массы.

Анализ рисков и план на случай непредвиденных обстоятельств. Если Т-клетки от пациентов с повышенным количеством Th17 в периферической крови не дадут положительного ответа на иммунный вызов с помощью ATCC 15707, мы проверим реактивность Т-клеток по отношению к другим микробам, повышенным в GM у пациентов с потерей кости PHPT. Штамм GM, способный стимулировать клетки Th17, будет выбран в соответствии с результатами, полученными в WP1. Чтобы определить положительную активацию Т-клеток, мы установили порог 70% положительных результатов для иммунного заражения в соответствии с нашими предварительными данными и предыдущими результатами, опубликованными PI.