原发性甲状旁腺功能亢进症和肠道菌群 (HYPOGEUM)

方法。 该项目将分为三个工作包 (WP)。 WP1。 确定是否可以通过粪便微生物组的组成（0-11 个月）预测 PHPT 患者发生骨质流失的倾向。 我们将筛查诊断为 PHPT 的 30-80 岁男性和女性，并通过 3 位点 DXA（腰椎、臀部和桡骨远端 - 1/3 和超远端）和骨转换标志物进行评估。 将纳入两组，每组 45 名患者：1) BMD 正常或轻度骨质减少（桡骨远端 T 评分 > -1.5）、无脆性骨折和与正常骨转换相关的 CTX 水平（100-250 pg/ml）的受试者）（不是骨松）。 2) 患有骨质疏松症（桡骨远端 T 评分 < -2.5）且伴有或不伴有一处或多处脆性骨折）且 CTX 水平与活动性疾病相关的受试者 (>500 pg/ml)（骨松动）。 每个参与者将收集血液样本和粪便样本。 粪便样本将立即储存在带有 -20°C 冷冻包的冷却器中，并储存在 -80°C 下，直到运送到 COSMOSID 进行 Metagenomic Shotgun 测序和微生物群落结构分析。

宏基因组学鸟枪法测序和分析。 每个粪便样本的微生物组多样性和组成将由马里兰州罗克维尔的 CosmosID Inc. 确定。 简而言之，将使用 QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit 从人类粪便样本中分离 DNA。 将使用 Illumina Nextera XT 文库制备试剂盒制备 DNA 文库，并使用 Qubit (ThermoFisher) 评估文库数量。 然后将在 Illumina HiSeq 平台 2x150bp 上对文库进行测序。 测序读数的生物信息学分析将由 CosmosID 生物信息学平台完成，该平台使用高性能数据挖掘算法和高度策划的动态比较数据库 GenBook®。

终点和解释：我们将确定与对照 PHPT 患者相比，松动骨质的 PHPT 患者是否具有更高频率的一种或多种 Th17 细胞诱导-SFB 等效细菌。 因此，该分析将产生与可能加剧 PHPT 骨丢失的物种和菌株有关的证据。 DXA 终点将是远端和 1/3 桡骨、腰椎和臀部的 BMD、T 分数和 Z 分数。

功效计算：我们对初步数据集的分析表明，BL 的平均相对丰度约为 5.8% (SD 0.055)。 根据这些数据，我们计算出每组招募 45 人将提供 80% 的统计功效来检测 BL 的差异，如果与对照组相比，低骨密度的 PHPT 患者的 BL 平均相对丰度 > 1.5 倍 (8.7%) PHPT 患者。

WP2。评估转基因成分如何调节人类的免疫系统（第 3-10 个月）。 为了评估 Th 亚群，将通过实时 RT-PCR 测量 FOXP3、IL-17A、TNF-α 和 IL-4 基因表达来分析 T 细胞。 简而言之，红细胞将在外周血样本中裂解，收集总有核细胞并在-80°C 下冷冻，直至提取 RNA。 根据标准程序，使用 TRIzol 试剂、氯仿提取和随后的异丙醇沉淀分离 RNA。 相对细胞因子表达将使用 2-ΔΔCT 方法确定，并归一化为 β-肌动蛋白。 为了评估炎症，我们将通过 ELISA 技术测量 IL-17A（Th17 细胞产生的 IL-17 的主要种类）、游离 RANKL、OPG、TNF。 为评估骨转换 P1NP（骨形成标志物）、CTX（骨吸收标志物）、25OH 维生素 D (25OHD)，将通过 ELISA 技术进行测量。

终点和解释。 数据将揭示骨吸收率、Th 细胞亚群与 IL-17 和其他细胞因子的血清水平之间存在相关性。 我们是否应该发现 GM 的成分反映了疾病的活动？这些数据将作为未来干预研究的基础，以确定抗生素或其他干预措施的疗效，例如益生菌在减轻 PHPT 骨骼并发症方面的作用。 我们还预计患有骨骼疾病的 PHPT 患者的 25OHD 水平将低于没有骨骼疾病的患者。 我们是否应该找到 25OHD 水平与有利于 Th17 细胞形成的细菌种类和菌株之间的相关性？该数据将提供有关 25OHD 水平如何影响 PHPT 骨病倾向的新机制信息。 如果是这种情况，未来干预研究的一个非常有吸引力的主题将是维生素 D 替代品将恢复与骨骼疾病无关的微生物群组成的命题。

风险分析和应急计划。 雌激素缺乏会扩张 Th17 细胞，它们产生的 IL-17 可能会导致人类绝经后骨质流失。 这种效应可能是一个重要的混杂因素，可能会限制评估 IL-17 在 PHPT 引起的早期绝经后妇女骨质流失中的作用。 如有必要，我们将通过对性别、年龄和更年期的影响进行统计调整来管理此限制。

WP3。评估 GM 成分与 T 细胞活化之间的因果关系（第 6-10 个月）。 为了评估 Th 细胞是否直接受到来自 SFB 等效细菌的蛋白质的刺激，我们将直接针对 BL ATCC 15707 测试外周血单核细胞 (PBMC)，并通过 ELISPOT 技术评估反应性 T 细胞的类型。 简而言之，将针对 BL ATCC 15707 测试来自外周血中 Th17 细胞增加的 10 名患者的 PBMC，并将通过 ELISPOT 分析测试 IL-17、TNF α 和 RANKL 的产生。 PBMC 内的这些细胞因子由 T 细胞在激活后特异性产生。 ELISPOT 技术允许在单个实验中测试多种蛋白质。 除 IL-17 外，TNF α 和 RANKL 已被选为候选细胞因子，因为申请人和其他人之前已显示来自绝经后骨质疏松症患者的 T 细胞中这些细胞因子水平升高。 如果我们发现 T 细胞直接激活为 BL ATCC 15707，则由于使用单细胞 RNA 测序技术 (scRNA-seq) 和 Fluidigm C1 系统，将进一步表征负责激活的 T 细胞类型它允许对每个细胞进行更深入的测序（大约 200.000 个读数）。 简而言之，来自 5 名应答患者的 PBMC 细胞将受到 ATCC 15707 或对照微生物（B. 脆弱) 6 小时。 孵育后，T 细胞将通过负免疫磁性细胞分离系统与全血有核细胞分离，并用 scRNA-seq 进行评估。 使用 scRNA-seq 将使我们能够表征活化的 T 细胞及其基因表达终点和解释。 我们将确定 ATC C 15707 是否能够直接激活 T 细胞，并进一步描述响应 T 细胞的类型。 这将使我们能够确认在研究的第一部分中获得的关联数据，并提供对 GM、免疫激活和骨质流失之间关系的机制洞察。

风险分析和应急计划。 如果外周血中 Th17 数量增加的患者的 T 细胞不能对 ATCC 15707 的免疫挑战做出积极反应，我们将测试 T 细胞对 PHPT 骨丢失者 GM 中增加的其他微生物的反应性。 将根据在 WP1 中获得的结果选择能够刺激 Th17 细胞的 GM 菌株。 为了定义阳性 T 细胞激活，我们根据我们的初步数据和 PI 公布的先前结果，将 70% 的阳性结果设定为免疫挑战的阈值。