원발성 부갑상선기능항진증과 장내 미생물군 (HYPOGEUM)

행동 양식. 이 프로젝트는 세 가지 작업 패키지(WP)로 구성됩니다. WP1. PHPT 환자의 뼈 손실 경향이 대변 미생물군집(0-11개월)의 구성으로 예측될 수 있는지 확인합니다. 우리는 PHPT 진단을 받고 3개 부위 DXA(요추, 고관절 및 원위 요골-1/3 및 초원위 모두) 및 뼈 전환 마커로 평가되는 30-80세의 남성과 여성을 선별할 것입니다. 각각 45명의 환자로 구성된 두 그룹이 등록됩니다: 1) 정상 BMD 또는 경미한 골감소증(원위 요골 T-점수 > -1.5), 취약성 골절이 없고 정상 골교체(100-250pg/ml)와 관련된 CTX 수준을 가진 대상체 ) (뼈가 느슨해지지 않음). 2) 하나 이상의 취약성 골절이 있거나 없는 골다공증(원위 요골 T-점수 < -2.5) 및 활동성 질환(>500 pg/ml)(골 이완)과 관련된 CTX 수준이 있는 피험자. 혈액 샘플과 대변 샘플은 각 참가자가 수집합니다. 대변 ​​샘플은 Metagenomic Shotgun 시퀀싱 및 미생물 군집 구조 분석을 위해 COSMOSID로 배송될 때까지 -20°C 냉동 팩과 함께 냉각기에 즉시 보관되고 -80°C에서 보관됩니다.

Metagenomics Shotgun 시퀀싱 및 분석. 각 대변 샘플의 미생물 다양성과 구성은 메릴랜드주 록빌에 있는 CosmosID Inc.에서 결정합니다. 간단히 말해서, 인간 대변 샘플의 DNA는 QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro 키트를 사용하여 분리됩니다. DNA 라이브러리는 Illumina Nextera XT 라이브러리 준비 키트 및 Qubit(ThermoFisher)로 평가된 라이브러리 수량을 사용하여 준비됩니다. 그런 다음 라이브러리는 Illumina HiSeq 플랫폼 2x150bp에서 시퀀싱됩니다. 시퀀싱 판독의 생물정보학적 분석은 고성능 데이터 마이닝 알고리즘과 고도로 선별된 동적 비교 데이터베이스 GenBook®을 사용하는 CosmosID 생물정보학 플랫폼에 의해 수행됩니다.

종점 및 해석: 우리는 뼈를 잃는 PHPT 환자가 대조군 PHPT 환자와 비교하여 하나 이상의 Th17 세포 유도 SFB 동등 박테리아의 빈도가 더 높은지 결정할 것입니다. 따라서 이 분석은 PHPT에서 뼈 손실을 악화시킬 수 있는 종 및 변종에 관한 증거를 산출할 것입니다. DXA 끝점은 원위 및 1/3 반경, 요추 및 고관절의 BMD, T-점수 및 Z-점수가 됩니다.

전력 계산: 예비 데이터 세트에 대한 우리의 분석은 BL이 ~5.8%(SD 0.055)의 평균 상대 풍부도로 풍부한 것으로 나타났습니다. 이 데이터로부터 우리는 그룹당 45명을 등록하면 대조군과 비교하여 골밀도가 낮은 PHPT 환자에서 BL의 평균 상대 풍부도가 > 1.5배(8.7%) 더 높은 경우 BL에 대한 차이를 감지하는 80% 통계적 검정력을 제공할 것이라고 계산했습니다. PHPT 환자.

WP2. GM 구성이 인간의 면역 체계를 조절하는 방법을 평가합니다(3-10개월). Th 하위 집합을 평가하기 위해 T 세포는 FOXP3, IL-17A, TNF-알파 및 IL-4 유전자 발현을 측정하는 실시간 RT-PCR로 분석됩니다. 요약하면, 적혈구는 말초 혈액 샘플에서 용해되고 총 유핵 세포는 수집되어 RNA 추출 전까지 -80°C에서 동결됩니다. RNA는 표준 절차에 따라 TRIzol 시약, 클로로포름 추출 및 후속 이소프로판올 침전을 사용하여 분리됩니다. 상대 사이토카인 발현은 β-액틴에 대한 정규화와 함께 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 결정될 것이다. 염증을 평가하기 위해 IL-17A(Th17 세포에 의해 생산되는 IL-17의 주요 종), free RANKL, OPG, TNF를 ELISA 기술로 측정합니다. 뼈 회전율을 평가하기 위해 P1NP(골 형성 마커), CTX(골 흡수 마커), 25OH비타민 D(25OHD)를 ELISA 기술로 측정합니다.

종점 및 해석. 데이터는 뼈 재흡수 속도, Th 세포 서브세트 및 IL-17 및 기타 사이토카인의 혈청 수준 사이의 상관관계의 존재를 밝힐 것입니다. GM의 구성이 질병의 활동을 반영한다는 것을 발견해야 하는가? 이 데이터는 예를 들어 PHPT의 골격 합병증을 완화하는 프로바이오틱스와 같은 항생제 또는 기타 개입의 효능을 결정하기 위한 향후 개입 연구의 기초가 될 것입니다. 또한 골격 질환이 있는 PHPT 환자는 골격 질환이 없는 환자보다 25OHD 수치가 낮을 것으로 예상됩니다. 25OHD 수준과 박테리아 종 및 Th17 세포 형성을 선호하는 균주 사이의 상관관계를 찾아야 합니까? 이 데이터는 25OHD 수준이 PHPT에서 뼈 질환 성향에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 새로운 기계 정보를 제공할 것입니다. 이 경우 향후 개입 연구에서 매우 매력적인 주제는 비타민 D 대체가 골격 질환과 관련되지 않은 미생물 구성을 복원할 것이라는 제안이 될 것입니다.

위험 분석 및 비상 계획. 에스트로겐 결핍은 Th17 세포를 확장시키고 이들의 IL-17 생산은 인간의 폐경 후 뼈 손실에 기여할 수 있습니다. 이 효과는 초기 폐경 후 여성에서 PHPT에 의해 유발된 뼈 손실에서 IL-17의 역할에 대한 평가를 제한할 수 있는 중요한 교란 요인을 나타낼 수 있습니다. 필요한 경우 성별, 연령 및 폐경기의 영향을 통계적으로 조정하여 이러한 제한을 관리합니다.

WP3. GM 구성과 T 세포 활성화 사이의 인과 관계를 평가합니다(6-10개월). Th 세포가 SFB 동등 박테리아의 단백질에 의해 직접 자극되는지 평가하기 위해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 BL ATCC 15707에 대해 직접 테스트하고 ELISPOT 기술로 반응하는 T 세포의 유형을 평가합니다. 간략하게, 말초 혈액에서 Th17 세포가 증가된 10명의 환자로부터의 PBMC는 BL ATCC 15707에 대해 시험될 것이고 IL-17, TNF 알파 및 RANKL의 생성은 ELISPOT 분석에 의해 시험될 것이다. PBMC 내의 이러한 사이토카인은 활성화 후 T 세포에 의해 특이적으로 생성됩니다. ELISPOT 기술을 사용하면 단일 실험에서 여러 단백질을 테스트할 수 있습니다. IL-17 이외의 TNF 알파와 RANKL이 신청인으로 후보 사이토카인으로 선정되었으며 다른 이들은 이전에 폐경 후 골다공증에 걸린 환자의 T 세포에서 이러한 사이토카인의 수준이 증가한 것으로 나타났습니다. BL ATCC 15707에 대한 T 세포의 직접적인 활성화를 발견하면 Fluidigm C1 시스템과 함께 단일 세포 RNA 시퀀싱 기술(scRNA-seq)을 사용하여 활성화를 담당하는 T 세포 유형을 추가로 특성화할 수 있습니다. 셀당 보다 심층적인 시퀀싱이 가능합니다(약 200.000 판독값). 간략하게, 5명의 반응자 환자로부터의 PBMC 세포는 ATCC 15707 또는 대조군 미생물(B. fragilis) 6시간 동안. 인큐베이션 후 T 세포는 음성 면역자기 세포 분리 시스템에 의해 전체 혈액 유핵 세포로 분리되고 scRNA-seq로 평가됩니다. scRNA-seq를 사용하면 활성화된 T-세포와 유전자 발현 종점 및 해석을 특성화할 수 있습니다. 우리는 ATC C 15707이 T 세포를 직접 활성화할 수 있는지 확인하고 추가로 반응하는 T 세포의 유형을 특성화할 것입니다. 이를 통해 연구의 첫 번째 부분에서 얻은 연관 데이터를 확인하고 GM, 면역 활성화 및 뼈 손실 사이의 관계에 대한 기계적 통찰력을 제공할 수 있습니다.

위험 분석 및 비상 계획. 말초 혈액에서 Th17 수가 증가한 환자의 T 세포가 ATCC 15707로 면역 공격에 긍정적으로 반응하지 않으면 PHPT 뼈 손실자의 GM에서 증가한 다른 미생물에 대한 T 세포 반응성을 테스트합니다. Th17 세포를 자극할 수 있는 GM 균주는 WP1에서 얻은 결과에 따라 선택됩니다. 양성 T 세포 활성화를 정의하기 위해 예비 데이터와 PI에서 발표한 이전 결과에 따라 면역 챌린지에 대한 양성 결과의 70% 임계값을 설정했습니다.