Primärer Hyperparathyreoidismus und Darmmikrobiota (HYPOGEUM)

Methoden. Das Projekt wird in drei Arbeitspaketen (AP) organisiert. WP1. Bestimmen Sie, ob die Neigung von Patienten mit PHPT, Knochenverlust zu entwickeln, durch die Zusammensetzung des Stuhlmikrobioms (Monat 0-11) vorhergesagt werden kann. Wir werden Männer und Frauen im Alter von 30-80 Jahren untersuchen, bei denen PHPT diagnostiziert wurde, und anhand von 3-Site-DXA (Lendenwirbelsäule, Hüfte und distaler Radius - sowohl 1/3 als auch ultra-distal) und Knochenumsatzmarkern bewertet. Zwei Gruppen mit jeweils 45 Patienten werden aufgenommen: 1) Probanden mit normaler BMD oder leichter Osteopenie (T-Score des distalen Radius > -1,5), ohne Fragilitätsfrakturen und CTX-Spiegel, die mit normalem Knochenumsatz einhergehen (100-250 pg/ml ) (nicht knochenloser). 2) Probanden mit Osteoporose (T-Score des distalen Radius < -2,5) mit oder ohne eine oder mehrere Fragilitätsfrakturen) und CTX-Spiegeln, die mit einer aktiven Erkrankung assoziiert sind (> 500 pg/ml) (Knochenlockerung). Blutproben und eine Kotprobe werden von jedem Teilnehmer gesammelt. Stuhlproben werden sofort in einem Kühler mit -20 °C Gefrierbeuteln gelagert und bis zum Versand an COSMOSID zur metagenomischen Shotgun-Sequenzierung und Analyse der Struktur der Mikrobiomgemeinschaft bei -80 °C gelagert.

Metagenomics Shotgun-Sequenzierung und -Analyse. Die Diversität und Zusammensetzung des Mikrobioms jeder Stuhlprobe wird von CosmosID Inc., Rockville, MD, bestimmt. Kurz gesagt, DNA aus menschlichen Stuhlproben wird mit dem QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit isoliert. DNA-Bibliotheken werden mit dem Illumina Nextera XT-Bibliotheksvorbereitungskit vorbereitet und die Bibliotheksmenge mit Qubit (ThermoFisher) bewertet. Bibliotheken werden dann auf einer Illumina HiSeq-Plattform 2x150bp sequenziert. Die bioinformatische Analyse von Sequenzierungs-Reads wird von der CosmosID-Bioinformatikplattform durchgeführt, die Hochleistungs-Data-Mining-Algorithmen und die hochgradig kuratierte dynamische Vergleichsdatenbank GenBook® verwendet.

Endpunkte und Interpretation: Wir werden bestimmen, ob PHPT-Patienten mit Knochenverlust eine höhere Häufigkeit von einem oder mehreren Th17-Zell-induzierenden SFB-äquivalenten Bakterien im Vergleich zu PHPT-Kontrollpatienten aufweisen. Diese Analyse wird daher Hinweise auf Arten und Stämme liefern, die den Knochenverlust bei PHPT verschlimmern können. Die DXA-Endpunkte sind BMD, T-Scores und Z-Scores des distalen und 1/3-Radius, der Lendenwirbelsäule und der Hüfte.

Leistungsberechnung: Unsere Analyse des vorläufigen Datensatzes ergab, dass BL bei einer mittleren relativen Häufigkeit von ~5,8 % (SD 0,055) reichlich vorhanden war. Aus diesen Daten errechneten wir, dass die Aufnahme von 45 pro Gruppe eine statistische Aussagekraft von 80 % zum Nachweis eines Unterschieds für BL liefert, wenn die mittlere relative Häufigkeit von BL bei PHPT-Patienten mit niedriger Knochendichte > 1,5-fach (8,7 %) höher ist als bei der Kontrollgruppe PHPT-Patienten.

WP2. Bewerten Sie, wie die GV-Zusammensetzung das Immunsystem beim Menschen moduliert (Monat 3-10). Um Th-Untergruppen zu bewerten, werden T-Zellen durch Echtzeit-RT-PCR analysiert, wobei die FOXP3-, IL-17A-, TNF-alpha- und IL-4-Genexpression gemessen wird. Kurz gesagt werden Erythrozyten in peripheren Blutproben lysiert und die gesamten kernhaltigen Zellen gesammelt und bei –80°C bis zur RNA-Extraktion eingefroren. RNA wird unter Verwendung von TRIzol-Reagenz, Chloroform-Extraktion und anschließender Isopropanol-Präzipitation gemäß Standardverfahren isoliert. Die relative Zytokinexpression wird unter Verwendung der 2-ΔΔCT-Methode mit Normalisierung auf β-Aktin bestimmt. Um die Entzündung zu beurteilen, messen wir IL-17A (die Hauptspezies von IL-17, das von Th17-Zellen produziert wird), freies RANKL, OPG, TNF durch ELISA-Technik. Zur Beurteilung des Knochenumsatzes werden P1NP (ein Marker der Knochenbildung), CTX (ein Marker der Knochenresorption), 25OHVitamin D (25OHD) durch ELISA-Technik gemessen.

Endpunkte und Interpretation. Die Daten werden die Existenz von Korrelationen zwischen der Knochenresorptionsrate, der Untergruppe der Th-Zellen und den Serumspiegeln von IL-17 und anderen Zytokinen offenbaren. Sollten wir feststellen, dass die Zusammensetzung des GM die Aktivität der Krankheit widerspiegelt; Die Daten werden als Grundlage für zukünftige Interventionsstudien dienen, um die Wirksamkeit von Antibiotika oder anderen Interventionen wie beispielsweise mit Probiotika zur Milderung der skelettalen Komplikationen von PHPT zu bestimmen. Wir erwarten auch, dass PHPT-Patienten mit Skeletterkrankungen niedrigere 25OHD-Werte haben werden als Patienten ohne Skeletterkrankung. Sollten wir eine Korrelation zwischen 25OHD-Spiegeln und Bakterienarten und -stämmen finden, die die Bildung von Th17-Zellen begünstigt; Die Daten werden neuartige mechanistische Informationen darüber liefern, wie 25OHD-Spiegel die Neigung zu Knochenerkrankungen bei PHPT beeinflussen. Sollte dies der Fall sein, wird ein sehr attraktives Thema für eine zukünftige Interventionsstudie die Behauptung sein, dass eine Vitamin-D-Substitution eine Mikrobiota-Zusammensetzung wiederherstellen wird, die nicht mit Skeletterkrankungen assoziiert ist.

Risikoanalysen und Notfallplan. Östrogenmangel erweitert die Th17-Zellen und ihre Produktion von IL-17 kann beim Menschen zum postmenopausalen Knochenschwund beitragen. Dieser Effekt könnte einen wichtigen Confounder darstellen, der die Bewertung der Rolle von IL-17 bei dem durch PHPT induzierten Knochenverlust bei Frauen in der frühen Postmenopause einschränken kann. Falls erforderlich, werden wir diese Einschränkung durch eine statistische Bereinigung um die Auswirkungen von Geschlecht, Alter und Menopause handhaben.

WP3. Bewerten Sie die kausale Beziehung zwischen GM-Zusammensetzung und T-Zellen-Aktivierung (Monat 6-10). Um zu beurteilen, ob Th-Zellen direkt durch Proteine ​​von SFB-äquivalenten Bakterien stimuliert werden, werden wir die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) direkt auf BL ATCC 15707 testen und die Art der antwortenden T-Zellen mit der ELISPOT-Technik bewerten. Kurz gesagt werden PBMCs von 10 Patienten mit erhöhten Th17-Zellen im peripheren Blut gegen BL ATCC 15707 getestet und die Produktion von IL-17, TNF alpha und RANKL wird durch ELISPOT-Analysen getestet. Diese Zytokine innerhalb der PBMCs werden nach ihrer Aktivierung spezifisch von T-Zellen produziert. Die ELISPOT-Technik ermöglicht das Testen mehrerer Proteine ​​in einem einzigen Experiment. TNF alpha und RANKL außer IL-17 wurden als Zytokinkandidaten ausgewählt, da der Anmelder und andere zuvor einen erhöhten Spiegel dieser Zytokine in T-Zellen von Patienten gezeigt haben, die von postmenopausaler Osteoporose betroffen sind. Sollten wir eine direkte Aktivierung von T-Zellen zu BL ATCC 15707 finden, wird der T-Zelltyp, der für die Aktivierung verantwortlich ist, dank der Verwendung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnik (scRNA-seq) mit dem Fluidigm C1-System weiter charakterisiert es ermöglicht eine tiefergehende Sequenzierung pro Zelle (ca. 200.000 Messwerte). Kurz gesagt werden PBMC-Zellen von 5 Responder-Patienten mit ATCC 15707 oder mit einer Kontrollmikrobe (B. zerbrechlich) für 6 Stunden. Nach der Inkubation werden die T-Zellen durch ein negatives immunomagnetisches Zellisolationssystem von kernhaltigen Gesamtzellen getrennt und mit scRNA-seq bewertet. Die Verwendung von scRNA-seq wird es uns ermöglichen, aktivierte T-Zellen und ihre Genexpression Endpunkte und Interpretation zu charakterisieren. Wir werden bestimmen, ob ATC C 15707 in der Lage ist, T-Zellen direkt zu aktivieren, und weiter werden wir den Typ der antwortenden T-Zelle charakterisieren. Dies wird es uns ermöglichen, die im ersten Teil der Studie erhaltenen Assoziationsdaten zu bestätigen und einen mechanistischen Einblick in die Beziehung zwischen GM, Immunaktivierung und Knochenverlust zu geben.

Risikoanalysen und Notfallplan. Wenn T-Zellen von Patienten mit einer erhöhten Anzahl von Th17 im peripheren Blut nicht positiv auf eine Immunherausforderung mit ATCC 15707 reagieren, werden wir die T-Zellen-Reaktivität gegenüber anderen Mikroben testen, die im GM von PHPT-Knochenverlierern erhöht ist. Der genetisch veränderte Stamm, der in der Lage ist, Th17-Zellen zu stimulieren, wird gemäß den in Arbeitspaket 1 erzielten Ergebnissen ausgewählt. Um eine positive T-Zell-Aktivierung zu definieren, legen wir gemäß unseren vorläufigen Daten und früheren vom PI veröffentlichten Ergebnissen einen Schwellenwert von 70 % positiver Ergebnisse für eine Immunprovokation fest.