Hyperparathyroïdie primaire et microbiote intestinal (HYPOGEUM)

Méthodes. Le projet sera organisé en trois groupes de travail (WP). WP1. Déterminer si la propension des patients atteints de PHPT à développer une perte osseuse peut être prédite par la composition du microbiome des selles (mois 0-11). Nous dépisterons les hommes et les femmes âgés de 30 à 80 ans diagnostiqués avec PHPT et évalués par DXA à 3 sites (colonne lombaire, hanche et rayon distal - à la fois 1/3 et ultra-distal) et des marqueurs de remodelage osseux. Deux groupes de 45 patients chacun seront recrutés : 1) Sujets présentant une DMO normale ou une ostéopénie légère (score T du rayon distal > -1,5), aucune fracture de fragilité et des taux de CTX associés à un remodelage osseux normal (100-250 pg/ml ) (pas d'os plus lâche). 2) Sujets atteints d'ostéoporose (score T du rayon distal < -2,5) avec ou sans une ou plusieurs fractures de fragilité) et taux de CTX associés à une maladie active (> 500 pg/ml) (os plus lâche). Des échantillons de sang et un échantillon fécal seront prélevés par chaque participant. Les échantillons de selles seront immédiatement stockés dans une glacière avec des packs de congélation à -20 ° C et stockés à -80 ° C jusqu'à leur expédition à COSMOSID pour le séquençage métagénomique Shotgun et l'analyse de la structure de la communauté du microbiome.

Métagénomique Séquençage et analyse Shotgun. La diversité du microbiome et la composition de chaque échantillon de selles seront déterminées par CosmosID Inc., Rockville, MD. En bref, l'ADN d'échantillons fécaux humains sera isolé à l'aide du kit QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro. Les bibliothèques d'ADN seront préparées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque Illumina Nextera XT et de la quantité de bibliothèque évaluée avec Qubit (ThermoFisher). Les librairies seront ensuite séquencées sur une plateforme Illumina HiSeq 2x150bp. L'analyse bioinformatique des lectures de séquençage sera effectuée par la plate-forme bioinformatique CosmosID qui utilise des algorithmes d'exploration de données haute performance et la base de données de comparaison dynamique hautement organisée GenBook®.

Points finaux et interprétation : Nous déterminerons si les patients PHPT perdant de l'os ont une fréquence plus élevée d'une ou plusieurs bactéries équivalentes induisant des cellules Th17-SFB par rapport aux patients témoins PHPT. Cette analyse fournira donc des preuves concernant les espèces et les souches qui peuvent aggraver la perte osseuse dans le PHPT. Les critères d'évaluation DXA seront la DMO, les scores T et les scores Z du rayon distal et 1/3, de la colonne lombaire et de la hanche.

Calcul de puissance : Notre analyse de l'ensemble de données préliminaire a révélé que BL était abondant à une abondance relative moyenne d'environ 5,8 % (ET 0,055). À partir de ces données, nous avons calculé que l'inscription de 45 personnes par groupe fournira une puissance statistique de 80 % pour détecter une différence pour BL si l'abondance relative moyenne de BL est > 1,5 fois (8,7 %) plus élevée chez les patients PHPT à faible densité osseuse par rapport au groupe témoin. Patients PHPT.

WP2. Évaluer comment la composition GM module le système immunitaire chez l'homme (mois 3-10). Afin d'évaluer les sous-ensembles Th, les cellules T seront analysées par RT-PCR en temps réel mesurant l'expression des gènes FOXP3, IL-17A, TNF-alpha et IL-4. En bref, les globules rouges seront lysés dans des échantillons de sang périphérique et les cellules nucléées totales seront collectées et congelées à -80 °C jusqu'à l'extraction de l'ARN. L'ARN sera isolé à l'aide du réactif TRIzol, de l'extraction au chloroforme et de la précipitation ultérieure à l'isopropanol conformément à la procédure standard. L'expression relative des cytokines sera déterminée à l'aide de la méthode 2-ΔΔCT avec normalisation à la β-Actine. Afin d'évaluer l'inflammation, nous allons mesurer l'IL-17A (la principale espèce d'IL-17 produite par les cellules Th17), le RANKL libre, l'OPG, le TNF par la technique ELISA. Pour évaluer le remodelage osseux, le P1NP (un marqueur de la formation osseuse), le CTX (un marqueur de la résorption osseuse), la 25OHvitamine D (25OHD) seront mesurés par la technique ELISA.

Points finaux et interprétation. Les données révéleront l'existence de corrélations entre le taux de résorption osseuse, le sous-ensemble de cellules Th et les taux sériques d'IL-17 et d'autres cytokines. Doit-on trouver que la composition du GM reflète l'activité de la maladie ; les données serviront de base à de futures études d'intervention pour déterminer l'efficacité des antibiotiques ou d'autres interventions comme, par exemple, avec des probiotiques pour atténuer les complications squelettiques de PHPT. Nous nous attendons également à ce que les patients atteints de PHPT avec une maladie squelettique aient des niveaux de 25OHD inférieurs à ceux sans maladie squelettique. Doit-on trouver une corrélation entre les niveaux de 25OHD et les espèces et souches bactériennes qui favorise la formation de cellules Th17 ? les données fourniront de nouvelles informations mécanistes sur la façon dont les niveaux de 25OHD affectent la propension aux maladies osseuses dans le PHPT. Si tel est le cas, un sujet très intéressant pour une future étude d'intervention sera la proposition selon laquelle le remplacement de la vitamine D restaurera une composition du microbiote qui n'est pas associée à une maladie du squelette.

Analyses de risques et plan d'urgence. La carence en œstrogène augmente les cellules Th17 et leur production d'IL-17 peut contribuer à la perte osseuse post-ménopausique chez l'homme. Cet effet pourrait représenter un important facteur de confusion, ce qui pourrait limiter l'évaluation du rôle de l'IL-17 dans la perte osseuse induite par la PHPT chez les femmes ménopausées précoces. Si nécessaire, nous gérerons cette limitation en ajustant statistiquement les effets du sexe, de l'âge et de la ménopause.

WP3. Évaluer la relation causale entre la composition GM et l'activation des lymphocytes T (mois 6-10). Afin d'évaluer si les cellules Th sont directement stimulées par des protéines de bactéries équivalentes SFB, nous testerons les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) directement vers BL ATCC 15707 et évaluerons le type de cellules T répondantes par la technique ELISPOT. En bref, les PBMC de 10 patients présentant une augmentation des cellules Th17 dans le sang périphérique seront testés contre BL ATCC 15707 et la production d'IL-17, de TNF alpha et de RANKL sera testée par des analyses ELISPOT. Ces cytokines, au sein des PBMC, sont produites spécifiquement par les lymphocytes T suite à leur activation. La technique ELISPOT permet de tester plusieurs protéines en une seule expérience. Le TNF alpha et le RANKL autres que l'IL-17 ont été sélectionnés comme cytokines candidates car le demandeur et d'autres ont précédemment montré un niveau accru de ces cytokines dans les cellules T de patientes atteintes d'ostéoporose post-ménopausique. Si nous trouvions une activation directe des lymphocytes T au BL ATCC 15707, le type de lymphocyte T responsable de l'activation sera davantage caractérisé grâce à l'utilisation de la technique de séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) avec le système Fluidigm C1 comme il permet un séquençage plus approfondi par cellule (environ 200.000 lectures). En bref, les cellules PBMC de 5 patients répondeurs seront provoquées avec ATCC 15707 ou avec un microbe contrôle (B. fragilis) pendant 6 heures. Après incubation, les cellules T seront séparées des cellules nucléées du sang total par un système d'isolement de cellules immunomagnétiques négatives et évaluées avec scRNA-seq. L'utilisation de scRNA-seq nous permettra de caractériser les lymphocytes T activés et leurs points terminaux d'expression génique et leur interprétation. Nous déterminerons si l'ATC C 15707 est capable d'activer directement les lymphocytes T et nous caractériserons en outre le type de lymphocyte T répondant. Cela nous permettra de confirmer les données d'association obtenues dans la première partie de l'étude et de fournir un aperçu mécaniste de la relation entre GM, activation immunitaire et perte osseuse.

Analyses de risques et plan d'urgence. Si les lymphocytes T de patients présentant un nombre accru de Th17 dans le sang périphérique ne répondent pas positivement à la provocation immunitaire avec ATCC 15707, nous testerons la réactivité des lymphocytes T vis-à-vis d'autres microbes augmentée dans le GM des perdants osseux PHPT. La souche GM capable de stimuler les cellules Th17 sera choisie en fonction des résultats obtenus dans le WP1. Afin de définir une activation positive des lymphocytes T, nous avons fixé un seuil de 70 % de résultats positifs à la provocation immunitaire conformément à nos données préliminaires et aux résultats antérieurs publiés par le PI.