Iperparatiroidismo primario e microbiota intestinale (HYPOGEUM)

Metodi. Il progetto sarà organizzato in tre pacchetti di lavoro (WP). WP1. Determinare se la propensione dei pazienti con PHPT a sviluppare perdita ossea può essere prevista dalla composizione del microbioma fecale (mesi 0-11). Effettueremo lo screening di uomini e donne di età compresa tra 30 e 80 anni con diagnosi di PHPT e valutati mediante DXA a 3 siti (colonna lombare, anca e radio distale, sia 1/3 che ultra-distale) e marcatori di turnover osseo. Saranno arruolati due gruppi di 45 pazienti ciascuno: 1) Soggetti con BMD normale o osteopenia lieve (T-score del radio distale > -1,5), senza fratture da fragilità e livelli di CTX associati a normale ricambio osseo (100-250 pg/ml ) (non più allentato). 2) Soggetti con osteoporosi (T-score del radio distale < -2,5) con o senza una o più fratture da fragilità) e livelli di CTX associati a malattia attiva (>500 pg/ml) (scioglimento osseo). Ogni partecipante raccoglierà campioni di sangue e un campione fecale. I campioni di feci verranno immediatamente conservati in un dispositivo di raffreddamento con confezioni freezer a -20°C e conservati a -80°C fino alla spedizione a COSMOSID per il sequenziamento Metagenomic Shotgun e l'analisi della struttura della comunità del microbioma.

Metagenomica Sequenziamento e analisi del fucile da caccia. La diversità e la composizione del microbioma di ciascun campione di feci sarà determinata da CosmosID Inc., Rockville, MD. In breve, il DNA da campioni fecali umani sarà isolato utilizzando il kit QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro. Le librerie di DNA saranno preparate utilizzando il kit di preparazione della libreria Illumina Nextera XT e la quantità di libreria valutata con Qubit (ThermoFisher). Le librerie saranno quindi sequenziate su una piattaforma Illumina HiSeq 2x150bp. L'analisi bioinformatica delle letture di sequenziamento sarà effettuata dalla piattaforma bioinformatica CosmosID che utilizza algoritmi di data mining ad alte prestazioni e il database di confronto dinamico altamente curato GenBook®.

Punti finali e interpretazione: determineremo se i pazienti con PHPT che perdono osso hanno una frequenza più alta di uno o più batteri equivalenti SFB che inducono cellule Th17 rispetto ai pazienti con PHPT di controllo. Questa analisi fornirà quindi prove relative a specie e ceppi che possono esacerbare la perdita ossea in PHPT. Gli endpoint DXA saranno BMD, punteggi T e punteggi Z del raggio distale e 1/3, colonna lombare e anca.

Calcolo della potenza: la nostra analisi del set di dati preliminari ha rivelato che BL era abbondante con un'abbondanza relativa media di ~ 5,8% (SD 0,055). Da questi dati abbiamo calcolato che l'arruolamento di 45 per gruppo fornirà l'80% del potere statistico di rilevare una differenza per BL se l'abbondanza relativa media di BL è > 1,5 volte (8,7%) più alta nei pazienti con PHPT con bassa densità ossea rispetto al controllo Pazienti PHPT.

WP2. Valutare come la composizione GM modula il sistema immunitario negli esseri umani (mese 3-10). Per valutare i sottogruppi Th, le cellule T saranno analizzate mediante RT-PCR in tempo reale misurando l'espressione genica di FOXP3, IL-17A, TNF-alfa e IL-4. In breve, i globuli rossi saranno lisati in campioni di sangue periferico e le cellule nucleate totali saranno raccolte e congelate a -80°C fino all'estrazione dell'RNA. L'RNA sarà isolato utilizzando il reagente TRIzol, l'estrazione con cloroformio e la successiva precipitazione con isopropanolo secondo la procedura standard. L'espressione relativa delle citochine sarà determinata utilizzando il metodo 2-ΔΔCT con normalizzazione a β-actina. Per valutare l'infiammazione misureremo IL-17A (la principale specie di IL-17 prodotta dalle cellule Th17), RANKL libero, OPG, TNF mediante tecnica ELISA. Per valutare il turnover osseo P1NP (un marker di formazione ossea), CTX (un marker di riassorbimento osseo), 25OHvitamina D (25OHD) saranno misurati mediante tecnica ELISA.

Punti finali e interpretazione. I dati riveleranno l'esistenza di correlazioni tra tasso di riassorbimento osseo, subset di cellule Th e livelli sierici di IL-17 e di altre citochine. Dovremmo scoprire che la composizione del GM riflette l'attività della malattia; i dati serviranno come base per futuri studi di intervento per determinare l'efficacia di antibiotici o altri interventi come, ad esempio, con i probiotici nel mitigare le complicanze scheletriche del PHPT. Ci aspettiamo anche che i pazienti con PHPT con malattia scheletrica abbiano livelli di 25OHD inferiori rispetto a quelli senza malattia scheletrica. Dovremmo trovare una correlazione tra i livelli di 25OHD e le specie e i ceppi batterici che favoriscono la formazione delle cellule Th17; i dati forniranno nuove informazioni meccanicistiche su come i livelli di 25OHD influenzano la propensione alla malattia ossea nel PHPT. In tal caso, un argomento molto interessante per un futuro studio di intervento sarà la proposta che la sostituzione della vitamina D ripristinerà una composizione del microbiota che non è associata a malattie scheletriche.

Analisi dei rischi e piano di emergenza. La carenza di estrogeni espande le cellule Th17 e la loro produzione di IL-17 può contribuire alla perdita ossea postmenopausale negli esseri umani. Questo effetto potrebbe rappresentare un importante confondente, che potrebbe limitare la valutazione del ruolo dell'IL-17 nella perdita ossea indotta dal PHPT nelle donne in postmenopausa precoce. Se necessario, gestiremo questa limitazione adattandoci statisticamente agli effetti del sesso, dell'età e della menopausa.

WP3. Valutare la relazione causale tra composizione GM e attivazione delle cellule T (mese 6-10). Per valutare se le cellule Th sono direttamente stimolate da proteine ​​di batteri SFB equivalenti testeremo le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) direttamente verso BL ATCC 15707 e valuteremo il tipo di cellule T rispondenti mediante tecnica ELISPOT. In breve, le PBMC di 10 pazienti con aumento delle cellule Th17 nel sangue periferico saranno testate contro BL ATCC 15707 e la produzione di IL-17, TNF alfa e RANKL sarà testata mediante analisi ELISPOT. Queste citochine, all'interno delle PBMC, sono prodotte specificamente dalle cellule T dopo la loro attivazione. La tecnica ELISPOT consente di testare più proteine ​​in un singolo esperimento. TNF alfa e RANKL diversi da IL-17 sono stati selezionati come citochine candidate poiché il richiedente e altri hanno precedentemente mostrato un aumento del livello di queste citochine nelle cellule T di pazienti affette da osteoporosi post-menopausale. Se dovessimo trovare un'attivazione diretta delle cellule T a BL ATCC 15707, il tipo di cellula T responsabile dell'attivazione sarà ulteriormente caratterizzato grazie all'uso della tecnica di sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) con il sistema Fluidigm C1 come consente un sequenziamento più approfondito per cella (circa 200.000 letture). In breve, le cellule PBMC di 5 pazienti responder saranno sfidate con ATCC 15707 o con un microbo di controllo (B. fragilis) per 6 ore. Dopo l'incubazione le cellule T saranno separate dalle cellule nucleate del sangue totale mediante un sistema di isolamento cellulare immunomagnetico negativo e valutate con scRNA-seq. L'uso di scRNA-seq ci permetterà di caratterizzare le cellule T attivate e la loro espressione genica End points e interpretazione. Verificheremo se ATC C 15707 è in grado di attivare direttamente le cellule T e caratterizzeremo ulteriormente il tipo di cellula T che risponde. Questo ci consentirà di confermare i dati di associazione ottenuti nella prima parte dello studio e fornire una visione meccanicistica della relazione tra GM, attivazione immunitaria e perdita ossea.

Analisi dei rischi e piano di emergenza. Se le cellule T di pazienti con un aumento del numero di Th17 nel sangue periferico non risponderanno positivamente alla sfida immunitaria con ATCC 15707, testeremo la reattività delle cellule T verso altri microbi aumentati nel GM dei perdenti ossei PHPT. I ceppi GM in grado di stimolare le cellule Th17 saranno scelti in base ai risultati ottenuti nel WP1. Al fine di definire un'attivazione positiva delle cellule T abbiamo fissato una soglia del 70% di risultati positivi al test immunitario in base ai nostri dati preliminari e ai risultati precedenti pubblicati dal PI.